Raziskovalni projekti

Vsebinski opis projekta 

Komercialna uporaba proteinov, vključno z encimi in bioterapevtiki, je pogosto omejena zaradi njihove nizke intrinzične stabilnosti in posledične izgube aktivnosti. Obstoječe pristope za termostabilizacijo proteinov lahko v grobem razdelimo na i) usmerjeno evolucijo proteinov in ii) racionalno načrtovanje proteinov. Usmerjena evolucija proteinov temelji na principih naravne evolucije, pri čemer generiramo veliko število naključno mutiranih različic gena za tarčni protein, jih prevedemo v protein in nato z ustrezno selekcijsko metodo izberemo termostabilizirane različice proteina. Racionalno načrtovanje proteinov pa temelji na usmerjeni zamenjavi vnaprej definiranih aminokislinskih ostankov z namenom povečanja števila stabilizirajočih interakcij znotraj proteina. Kljub napredku računskih algoritmov za racionalno načrtovanje proteinov, usmerjena evolucija ostaja močno orodje za termostabilizacijo proteinov. Potencial tega pristopa še ni v celoti izkoriščen, saj je zmogljivost obstoječih metod za selekcijo termostabilnih proteinov iz ogromnega nabora naključnih mutantov proteina omejena.

V sklopu projekta bomo izboljšali zmogljivost usmerjene evolucije proteinov proti višji termostabilnosti, pri čemer bomo z naključno mutagenezo generirali veliko število različic gena za tarčni protein, jih prevedli s prikazom mRNA in to sklopili s selekcijo na osnovi konformacijske stabilnosti proteinov pri višjih temperaturah. Za ta namen bomo prilagodili proteaze iz termofilnih organizmov, ki sicer v celicah razgrajujejo nepravilno zvite in poškodovane proteine. Predvidevamo, da bodo omenjene proteaze pri povišani temperaturi zmožne razgradnje konformacijsko neurejenih različic tarčnega proteina, stabilne različice pa se ne bodo razgradile. Nerazgrajene različice bomo ulovili na trdne nosilce preko specifičnih oznak in pripadajoče molekule mRNA reverzno prepisali in ponovno pomnožili. Tekom več ciklov prikaza mRNA – selekcije s proteazami bomo knjižnico DNA obogatili z zapisi za termostabilne različice. Kot modelni encim za razvoj omenjene metodologije bomo uporabili PETazo, encim ki, razgraja polietilen tereftalat. Ta encim je potencialno izjemno uporaben, saj njegov substrat (PET plastika) predstavlja enega izmed najbolj problematičnih onesnažil. Da bomo pridobili termostabilizirane PETaze z ohranjeno oziroma izboljšano katalitično aktivnostjo, bomo DNA knjižnico, obogateno z zapisi za termostabilne PETaze, selekcionirane s prej opisanim mRNA-prikazom, uporabili za nadaljnje presejanje PETaz glede na njihovo aktivnost. Pri tem bomo združili brezcelično sintezo proteinov ter in vivo pregledovanje transformiranih bakterijskih kolonij. Termostabilizirane PETaze bomo biokemijsko in biofizikalno okarakterizirali s stališča njihove temperaturne stabilnosti in aktivnosti na substrate iz PET, s čimer bomo dobili vpogled v različne vplive stabilizirajočih mutacij. Z novimi pristopi, ki jih bomo razvili v sklopu prijavljenega projekta, bomo poglobili razumevanje mehanizmov temperaturnih prilagoditev PETaz ter ponudili napredne strategije za razvoj industrijsko zanimivih encimov ter ostalih proteinov z želeno temperaturno stabilnostjo.

Zunanja povezava na Sestava projektne skupine  Odpira se v novem oknu

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta:

• Oddelek za živilstvo, Skupina za biokemijo in kemijo živil 
• Oddelek za biologijo, Skupina za biokemijo 
• Oddelek za lesarstvo, Patologija in zaščita lesa

Univerza v Mariboru, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo:

• Laboratorij za fizikalno kemijo in kemijsko termodinamiko 

Faze projekta in njihova realizacija 

Faza 1 (mesec 1 – mesec 8): Identifikacija in prilagoditev proteaz za razlikovanje med nestabilnimi in stabilnimi proteini pri povišanih temperaturah

Faza 2 (mesec 8 – mesec 28): Implementacija metode prikaza mRNA, sklopljenega s selekcijo termostabiliziranih različic PETaz z izbranimi proteazami

Faza 3 (mesec 28 – mesec 36): Karakterizacija termostabiliziranih PETaz 

Partnerji v projektu

• UM FKKT - UM Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo