Akronim:

J1-70027

Oddelek:

Oddelek za biologijo

Tip projekta:

ARIS

Vrsta projekta:

Temeljni

Vloga na projektu:

Vodilni

Financiranje:

ARIS

Trajanje:

01.03.2026 - 28.02.2029

Vrednost projekta skupaj:

1,66 FTE

Vodja projekta na BF:

Čremožnik Zupančič Jerneja

Sodelujoče RO

  • 481 Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta

  • 105 Nacionalni inštitut za biologijo

  •  618 Znanstvenoraziskovalni center Slovenske akademije znanosti in umetnosti

  •  1540 Univerza v Novi Gorici 


​

Vsebinski opis projekta 

Protimikrobna odpornost (AMR) je dandanes pomembna tema, saj se zaradi zlorabe in prekomerne uporabe antibiotikov v vseh delih sveta le-ta dviguje na nevarno visoko raven. Geni za odpornost proti antibiotikom (ARG) so bili v zadnjem desetletju odkriti v vseh okoljih, vključno z naravnimi, antropogenimi in kliničnimi habitati. Antropogene dejavnosti, vključno s klinično uporabo antibiotikov, na splošno veljajo za glavna gonila širjenja ARG, saj številni genetski mehanizmi, kot so konjugacija, transformacija in transdukcija, omogočajo mikroorganizmom razvoj, prilagajanje in preživetje v okoljih, onesnaženih z antibiotiki in ARG. Vodna okolja imajo ključno vlogo pri širjenju genov za odpornost na antibiotike (ARG), saj so tako končni sprejemni ekosistemi večine antropogenih odplak, ki vsebujejo ARG (komunalna odpadna voda, odtok s polj in živinorejskih objektov, ...) kot tudi glavni viri rekreativnega, namakalnega okolja in nenazadnje tudi vir pitne vode. Po vsem svetu priljubljenost rekreacijskih dejavnosti, ki vključujejo stik z vodo, še naprej narašča, vendar obstaja nekaj možnih mikrobioloških zdravstvenih tveganj zaradi udeležbe v teh dejavnostih, saj je pri kopanju izpostavljenost ljudi ARB in ARG možno preko stika vode s kožo, očmi ali ušesi, vdihavanja in zaužitja. Voda torej lahko povzroči okužbe, ki jih je težko zdraviti.

Večina klinično pomembnih ARG ni naključno porazdeljenih v genomih bakterij, ki so odporne na antibiotike (ARB), temveč je združenih v mobilne genetske elemente(MGE), kot so plazmidi ali transpozoni, ki omogočajo horizontalni prenos ARG med bakterijami. ARG/MGE se lahko prenašajo kot del genomov ARB (konjugacija), znotraj kapsid bakteriofaga (ali enostavnega faga) (transdukcija) ali pa se sprostijo kot prosta DNK (transfekcija). Pokazalo se je, da kapside okoljskih fagov pogosto prenašajo ARG. Ker fagni genomi redko kodirajo ARG, je ta vsebnost ARG/MGE v kapsidah faga v glavnem sestavljena iz bakterijske DNA, ki je bolj ali manj naključno inkapsulirana. Zato je pomembno zagotoviti nove vpoglede v vlogo okoljskih fagov pri širjenju ARG/MGE in njihovi okoljski porazdelitvi.

Kopalne vode se ocenjujejo glede na skladnost z vnaprej določenimi standardi (skupni koliformi, fekalni koliformi, fekalni streptokoki, Salmonela, enterovirusi, E. coli in črevesni enterokoki). V EU je kakovost kopalnih voda urejena z Direktivo o kopalnih vodah (BWD). Trenutno je v rekreacijskih vodnih okoljih merjenje števila mikrobov za določanje kakovosti osredotočeno le na vodo, ne na sedimente, kljub dejstvu, da so sedimenti močno obremenjeni z virusi fekalnega izvora in indikatorskimi fagi, skupaj z ARG, ki jih prenašajo. Trenutni BWD (2006/7/ES) spremlja kakovost vode v določenih kopalnih vodah in se osredotoča na štetje fekalnih indikatorskih organizmov (FIO); E. coli in črevesni enterokoki. Fagi so na tej stopnji v kopalni vodi popolnoma zanemarjeni, čeprav Direktiva o pitni vodi (2020/2184) vključuje metode za odkrivanje somatskih in F-specifičnih kolifagov v rednem spremljanju. Noben tak odstavek ni vključen v BWD, saj se zdi, da prisotnost in biološka nevarnost fagov v kopalni vodi zanemarljiva. Za zbiranje novega znanja in zapolnitev obstoječih vrzeli o potencialni vlogi fagov pri nastanku in širjenju odpornosti na antibiotike v okolju kopalnih voda bomo uporabili različne metode vzorčenja vode in usedlin, konvencionalno gojenje in od gojenja neodvisno metagenomsko analizo. Pristop, ki temelji na gojenju, je še vedno potreben za preučevanje dejanskega horizontalnega prenosa, frekvenc prenosa, gostiteljskih in okoljskih dejavnikov, ki vplivajo na frekvence prenosa ARG preko plazmidov in/ali fagov, vključno z njihovim obsegom gostiteljev, saj teh podatkov ni mogoče pridobiti samo z bioinformatičnim analizami in končno, vse pridobljene podatke bomo zbrali in ovrednotili s statistično analizo in napovedjo modelov, ki temeljijo na osnovi strojnega učenja.

Predlagani projekt ima 3 glavne cilje in sicer – molekularna določitev fageoma kopalnih voda z metodami novih generacij ter metagenomsko analizo ARG znotraj fageoma kopalnih voda; gojitvena metoda izolacije bakteriofagov iz kopalnih voda s sočasno osamitvijo bakterij, ki imajo v svoj genom vključeno fagno DNA (profagi) ter njihova AMR in kot zadnji cilj, določitev bremena ARG v kopalnih vodah in vloga ter pogostost prenosa teh genov v okolju preko bakteriofagov. Pristop, ki temelji na gojenju, je še vedno potreben za preučevanje dejanskega horizontalnega prenosa, frekvenc prenosa, gostiteljskih in okoljskih dejavnikov, ki vplivajo na frekvence prenosa ARG prek plazmidov in/ali fagov, vključno z njihovim obsegom gostiteljev, saj teh podatkov ni mogoče pridobiti samo z bioinformatičnim analizami.

 

Sestava projektne skupine 
 

BF

 

NIB

 

ZRC SAZU

 

UNG

 


Faze projekta in njihova realizacija 

Projekt je razdeljen v šest vsebinsko in časovno povezanih faz, ki skupaj omogočajo celostno obravnavo vloge bakteriofagov pri prenosu genov za odpornost proti antibiotikom v naravnih kopalnih vodah.

1. faza: Vzorčenje in osnovna karakterizacija okolja
V prvi fazi bo izvedeno sistematično terensko delo na izbranih naravnih kopalnih območjih Blejskega jezera. Vključuje vzorčenje kopalne vode in sedimentov ter merjenje osnovnih fizikalno-kemijskih parametrov. Ta faza zagotavlja reprezentativne vzorce in okolijske podatke, ki so osnova za vse nadaljnje analize. Zbiranje vzorcev bo trajalo 24 mesecev.

2. faza: Molekularna analiza fagoma in prisotnih ARG v fageomu
V drugi fazi bodo uporabljeni sodobni molekularni pristopi, ki niso odvisni od gojenja živih kultur. Po koncentraciji virusnih delcev in izolaciji virusne DNA bo izvedena metagenomska analiza (shotgun sekvenciranje), s katero se bo določila sestava fagoma ter identifikacija in analiza genov za odpornost proti protimikrobnim učinkovinam (ARG), prisotnih v virusnih genomih. Ta faza omogoča vpogled v celoten potencial fagoma kot rezervoarja ARG v kopalnih vodah.

3. faza: Klasične gojitvene metode za izolacijo bakterij in bakteriofagov
Tretja faza je namenjena eksperimentalni potrditvi ugotovitev iz metagenomskih analiz. Vključuje izolacijo in identifikacijo izbranih bakterij (npr. E. coli in sorodnih filogenetskih skupin), izolacijo in čiščenje bakteriofagov iz vode in sedimenta ter zaznavanje fagov z vključenimi ARG. Poseben poudarek bo na izolaciji t. i. jumbo fagov.

4. faza: Določanje potenciala horizontalnega prenosa genov
V četrti fazi bo ocenjen dejanski potencial horizontalnega prenosa ARG v okolju. Vključuje analizo fagov iz bakterijskih izolatov, proučevanje lizogenih in kolifagov v naravnem okolju ter eksperimentalno oceno prenosa ARG preko fagov v modelne bakterijske gostitelje. Ta faza je ključna za razumevanje mehanizmov in pogostosti prenosa odpornosti v naravnih vodnih ekosistemih.

5. faza: Statistična obdelava podatkov in napredne analize
V peti fazi bodo zbrani podatki celostno obdelani s statističnimi in bioinformatskimi metodami, vključno z metodami strojnega učenja. Namen faze je identifikacija vzorcev, povezav med okolijskimi dejavniki, fageomi in ARG ter priprava analiz trajnosti in dolgoročnih okolijskih  tveganj.

6. faza: Interpretacija rezultatov, upravljanje projekta in diseminacija
Zaključna faza zajema interpretacijo rezultatov, oceno tveganj, projektno vodenje ter razširjanje znanja. Vključuje partnerska srečanja, identifikacijo virov in poti širjenja ARG ter objavo rezultatov v znanstvenih revijah in odprtih podatkovnih zbirkah, s čimer se zagotavlja prenos znanja v znanstveno in strokovno javnost v skladu s pristopom »One Health«.