Raziskovalni projekti

Vsebinski opis projekta

Glavni cilj projekta je razvoj nove metode molekularnega slikanja MeV-SIMS, ki bi omogočila slikanje težkih molekul (težjih od 1 kDa) na podmikronski in podcelični ravni. Tako zmogljiva metoda molekularnega slikanja bi bila posebej zanimiva za vede kot so medicina, biomedicina in biologija, kjer prostorske razporeditve biomolekul še vedno ni mogoče ustrezno izmeriti, kljub izredno pomembni informaciji, ki jo ta podaja.

Sekundarna ionska masna spektrometrija (SIMS) je med najbolj pogosto uporabljanimi metodami molekularnega slikanja. Znana je kot metoda z najboljšo ločljivostjo, ki lahko doseže tudi do 50 nm v primeru monoatomarnih kovinskih ionov. Po drugi strani pa je SIMS znan tudi po svoji destruktivni naravi izbijanja sekundarnih ionov, kar se odraža v visokem deležu fragmentiranih molekul, sočasno pa je zelo nizek tudi delež ioniziranih molekul (približno 10 - 5). Tovrstni problemi so delno rešeni z uporabo večjih skupkov v primarnih ionih, kajti tako se energija primarnega iona deli s številom atomov v skupku. Četudi je tovrsten pristop delno rešil problem metode SIMS, je generacija takih ionov močno vplivala na ločljivost metode. Alternativni pristop je nišna metoda MeV-SIMS, kjer vzorec obstreljujemo z ioni energije MeV (in ne keV kot pri navadnem SIMS-u). Prek hitrejših ionov se spremeni tudi proces desorpcije, ki z višanjem energij primarnih ionov vedno bolj teži od nuklearnega izbijanja do elektronskih ekscitacij. Tak, t.i. electron stopping, proces je mnogo bolj nežen do vzorca in ne povzroči veliko fragmentacije. Prek hitrih ionov so bile prikazane tudi desorpcije zelo težkih molekul z maso prek 10 kDa. Seveda pa je manipulacija tako hitrih ionov zelo zahtevna, kar močno oteži fokusiranje ionskega žarka.

V okviru projekta nameravamo razviti rutinsko dostopno metodo masnega slikanja, kjer bi generirali ione z energijo MeV na napraševalnem izvoru ionskega pospeševalnika, ki bi jih nato pospešil do končne energije. Nato bi žarek oklestili na zelo nizko intenziteto in ga v kontinuiranem načinu pošiljali do tarče. Slednje bi omogočilo fokusacijo žarka na velikost med 500nm do 1um. Primarne ione bi nato detektirali prek sekundarnih elektronov. Ko bi bil elektron zaznan, bi dvignili napetost na vzorcu in pozitivni ioni bi bili pospešeni v masni spektrometer, ki deluje po načinu časa preleta. Signal elektronov bi služil tudi kot "start" signal za merjenje časa preleta, signal iz MCP detektorja na koncu spektrometra, pa bi prispeval "stop" signal.

Prav tako nameravamo razviti moderno metodo preparacije vzorcev, ki bi omogočila podmikronsko slikanje nepoškodovanih celic, zmogljivost metode pa bi demonstrirali z analizo rastlinskih tkiv. Da bi še dodatno povečali pridelek sekundarnih ionov, bomo raziskali tudi različne načine priprave vzorcev, ki so se pri analizi z navadnim SIMS izkazali kot učinkovite pri boljši efektivnosti metode.

Sestava projektne skupine

Zunanja povezava na povezava na Sicris Odpira se v novem oknu

IJS:

• dr. Boštjan Jenčič
• dr. Mitja Kelemen
• prof.dr. Primož Pelicon
• doc dr. Paula Pongrac (od 1.1.2026)
• Mirjana Sepahyar Lorentzen
• dr. Primož Vavpetič

BF:

• Valentna Bočaj
• Žan Cimerman
• Doc. Dr. Matevž Likar
• Ana Mezinec (od 1.1.2026)
• Dr. Jure Mravlje
• Doc. dr Paula Pongrac
• Prof. dr. Marjana Regvar
• Tanja Sunčič (do 31.12.2025)
• Dr. Katarina Vogel Mikuš

Faze projekta in njihova realizacija

1. Faza: Učinkovita detekcija kontinuiranih primarnih ionov

Prihod primarnega iona na vzorec bo zaznan preko sekundarnih elektronov. CEM detektor bo postavljen pred vzorec, zraven rilca masnega spektrometra. V DP 1 bomo optimizirali razdaljo in kot med detektorjem in tarčo, prav tako tudi napetost na detektorju. Želimo si blizu 100% učinkovito zaznavo primarnih ionov, prav tako želimo eliminrati vse neželene perturbacije zaradi CEM detektorja. Tok primarnih ionov bomo merili z drugim CEM detektorjem, ki bo postavljen na osi primarnih ionov, in nato primerjali frekvenco zaznavanja obeh detektorjev. Prav tako bomo pomerili spektre z in brez dodanega CEM detektorja za SE, ter jih optimizirali.

2. Faza: Učinkovit transport sekundarnih ionov

Po desorpciji imajo sekundarni ioni energije med 0 in 10 eV, najbolj pogosto okoli 5eV. Slednje pomeni, da jih lahko pospešimo v spektrometer po približno 150 ns, odvisno tudi od njihove mase – težji ioni čakajo dlje. Ker želimo dvigovati napetost velikosti okoli 5 kV šele po detekciji SE, imamo za procesiranje signala precej malo časa. Negativni signal iz CEM detektorja mora biti namreč sprva ojačan, nato pa pretvorjen v pozitivni signal dolžine med 3 in 5 mikrosekund, kolikor časa traja, da pometemo vse ione v spectrometer. Posebej temu namenjen pretvornik signal bo skonstruiran, kar bi omogočilo dovolj hitro procesiranja signala v želeno obliko.

3. Faza: Razvoj preparacije zamrznjenih tkiv in protokol meritve MeV-SIMS za rutinsko analizo

Sodelovali bomo z biotehniško fakulteto univerze v Ljubljani. Cilj je razvoj rutinske metode priprave zamrznjenih tkiv. Vzorci bodo rezani na debeline med 10 in 60 mikronov s kriotomom, nato zamrznjeni v tekočem dušiku, kar bo preprečilo morebiten nastanek kristalov znotraj celic. Kasneje bodo zamrznjeni vzorci vstavljeni v eksperimentalno calico in tam hlajeni prek stika z rezervarjem s tekočim dušikom. Skonstuirati nameravamo tudi poseben nosilec za vzorce, ki bo omogočal visoko napetost na tarči, hkrati pa bo imel visoko toplotno prevodnost. Kasneje bomo analizirali biološka tkiva, kjer bomo preverjali vpliv abiotskih vplivov (soli, težkih kovin) na kemijske procese znotraj bioloških tkiv prek analize razporeditve biomolekul.

4. Faza: Dodatno zviševanje pridelka sekundarnih ionov

Vrednost pridelka sekundarnih ionov se ponavadi poda za referenčne vzorce, kjer je koncentracija takšnih molekul velika. V živih tkivih je seveda ogromno različnih biomolekul, ki imajo precej nizke koncentracije. Za razumevanje procesov, bi radi mapirali tudi slednje, kar je verjetno mogoče zgolj z nekaterimi protokoli, ki omogočajo višji pridelek ionov. Trije glavni načini bodo: napraševanje ogljika, napraševanje kovin, kot sta srebro in zlato, ter dodajanje majhnih količin soli. Sprva bomo merili učinek na referenčnih standardih arginina, holesterola in polyethylene glycola velikosti 600, 1000, 2000 in 3000. Nato bomo analizirali tudi vpliv takšnih snovi na organsko tkivo in preverili, kakšen vpliv ima takšna manipulacija vorcev na kvaliteto sliko in kako se vzorci spremenijo.

Reference

Lorentzen et al., 2025: The Static Limit in MeV Secondary Ion Mass Spectrometry, Zunanja povezava na https://doi.org/10.1021/jasms.5c00024 Odpira se v novem oknu

Regvar et al., 2025: Correlative Imaging of Structural Biochemistry in Plant and Food Quality Research Within and Interoperable Data Acquisition Platform, Zunanja povezava na https://doi.org/10.1093/mam/ozaf057 Odpira se v novem oknu