Raziskovalni projekti

Vsebinski opis projekta 

Bolezen verticilijske uvelosti se pojavlja po vsem svetu in prizadene tako enoletnice kot tudi trajne lesnate rastline ter pomembno vpliva na proizvodnjo hrane in krme. Gliva Verticillium nonalfalfae v Sloveniji povzroča znatno škodo pri pridelavi hmelja (Humulus lupulus L.). Za velike izgube pridelka je še posebej odgovoren bolj virulenten patotip glive, ki se je pojavil leta 1997 in se še danes sporadično pojavlja na hmeljiščih. Zaradi obsežnosti škode, ki jo povzročajo glive rodu Verticillium, za katere ni učinkovitih fitofarmacevtskih sredstev za zatiranje, je potrebno intenzivno preučevanje mehanizmov obrambe rastlin pred temi škodljivci ter pridobivanje odpornih rastlin z uporabo sodobnih biotehnoloških metod.

MikroRNA (miRNA) so majhne endogene nekodirajoče RNA, ki na posttranskripcijski ravni uravnavajo izražanje številnih genov z razrezom transkriptov genov (tarče miRNA) in tako preprečujejo njihovo prevajanje v proteine. Številne tarče ohranjenih miRNA kodirajo transkripcijske faktorje, ki uravnavajo rast in razvoj rastlin. Zato lahko igrajo ohranjene miRNA ključno vlogo pri univerzalnih regulativnih mehanizmih pri različnih rastlinskih vrstah. Poleg tega raziskave kažejo, da miRNA in njihove tarče pomembno sodelujejo pri obrambnih odzivih na različne biotske in abiotske dejavnike stresa. miRNA ne uravnavajo le izražanja genov, povezanih z obrambo, ampak tudi modulirajo prenos signalov in hormonsko signalizacijo.

V naših predhodnih raziskavah smo identificirali miRNA, ki kažejo diferenčno izražanje v odpornem in občutljivem kultivarju hmelja v zgodnji fazi okužbe z V. nonalfalfae in izvedli in silico napoved tarč teh miRNA. V tem projektu želimo raziskati vlogo miR408, ki bi lahko sodelovala v obrambnem odzivu odporne sorte hmelja z uravnavanjem izražanja gostiteljevih genov miR408 in de novo nastankom korenin. Zato želimo:

- preučiti časovne vzorce izražanja miR408 in njenih tarčnih genov po okužbi hmelja z glivo V. nonalfalfae,

- potrditi specifično interakcijo med miR408 in njenimi tarčnimi transkripti,

- z uporabo tehnologije CRISPR/Cas9 pridobiti rastline hmelja z izbitimi miR408 geni,

- raziskati vlogo miR408 pri odpornosti hmelja na okužbo z V. nonalfalfae.

Eksperimentalni pristop predlaganega projekta se osredotoča na molekularne interakcije med rastlinami in patogeni z uporabo orodij funkcionalne biologije in transkriptomike, vključno s tehnikami preurejanja genomov, sekvenciranjem majhnih RNA in kontroliranimi poskusi okuževanja. Rezultati naše študije ne bodo samo prispevali k razumevanju temeljnih funkcij miRNA, ampak lahko tudi pripomorejo k razvoju novih strategij, ki temeljijo na miRNA za preprečevanje bolezni verticilijske uvelosti pri agronomsko pomembnih rastlinah.

Zunanja povezava na Sestava projektne skupine  Odpira se v novem oknu

• Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta (Oddelek za agronomijo; Katedra za genetiko, biotehnologijo, statistiko in žlahtnjenje rastlin; programska skupina P4-0077 Kmetijske rastline - genetika in sodobne tehnologije):
  - Ester Stajič (38120), Nataša Štajner (19184), Jernej Jakše (16379), Vanja Miljanić (57117), Helena Volk (37428), Taja Jeseničnik (37427), Tjaša Cesar (50811)
   
• Inštitut za hmeljarstvo in pivovarstvo Slovenije (IHPS; Oddelek za varstvo rastlin in Oddelek za rastline, tla in okolje):
  - Sebastjan Radišek (20162), Tanja Guček (36371), Maja Dobrajc (51925), Andreja Čerenak (18828), Lucija Luskar (53760), Monika Oset Luskar (23196)

Faze projekta in njihova realizacija 

DS1: Umetno okuževanje rastlin hmelja in vrednotenje kolonizacije glive po okužbi

V okviru tega delovnega sklopa bomo izvedli umetno okuževanje odpornega kultivarja hmelja ‘Wye Target’, ki vsebuje toleranco na verticilijsko uvelost iz ameriškega genskega materiala, z visoko virulentnim sevom PG2 glive V. nonalfalfae. Uspešnost okužbe (prisotnost glive) bo določena s kvantitativno verižno reakcijo s polimerazo (qPCR).

DS2: Validacija predvidenih tarč miRNA

V DS2 bodo uporabljeni vzorci inokuliranih rastlin hmelja iz DS1 za določanje izražanja miR408 in njenih tarč med potekom okužbe z V. nonalfalfae, z namenom opredelitve časovne dinamike izražanja miRNA in tarč v zgodnjih fazah patogeneze verticilijske uvelosti. Interakcija med miR408 in njenimi tarčami bo analizirana v izbranih časovnih točkah vzorčenja z metodo RLM-RACE.

DS3: Priprava različnih CRISPR/Cas9 vektorjev in njihova validacija v protoplastih hmelja

Cilj DS3 je prehodno izražanje sgRNA za preurejanje miR408 s CRISPR/Cas9 v protoplastih hmelja, da bi preverili njihovo učinkovitost preurejanja ter vpliv induciranih mutacij na biogenezo in funkcijo miRNA.

DS4: Stabilna transformacija in funkcionalna analiza

V tem delovnem sklopu bomo pridobili rastline hmelja z izbitim miR408 genom in jih umetno okužili z glivo V. nonalfalfae z namenom preučevanja vloge te miRNA v odzivu rastline na okužbo. Pri občutljivi sorti hmelja želimo vzpostaviti stanje, ki bo posnemalo naravno znižano izražanje miR408, opaženo pri odporni sorti, kar bo omogočilo oceno njene funkcionalne vloge pri odzivu na patogena.

DS5: Vodenje projekta in diseminacija rezultatov (meseci 1–36)

DS5 zajema vodenje projekta, ki ga bo izvajala vodja projekta v sodelovanju z vodji posameznih delovnih sklopov. Diseminacija rezultatov projekta je namenjena tako splošni javnosti kot znanstveni skupnosti in bo potekala prek različnih aktivnosti obveščanja in ozaveščanja (npr. spletne strani, družbena omrežja in članki v časopisih) ter javnih predavanj za popularizacijo znanosti. Rezultati projekta bodo predstavljeni na nacionalnih in mednarodnih konferencah, srečanjih in delavnicah ter objavljeni v visoko uvrščenih odprtodostopnih znanstvenih revijah. Projekt ima potencial vplivati tako na širšo znanstveno skupnost kot tudi na relevantne oblikovalce politik in odločevalce.

Partnerji v projektu

• IHPS - Inštitut za hmeljarstvo in pivovarstvo Slovenije