Raziskovalni projekti

VSEBINSKI OPIS PROJEKTA

V evropskih rekah živi sladkovodna vrsta lipan Thymallus thymallus, ki se pojavlja v več evolucijskih linijah, vezanih na različna geografska območja. Sem sodita tudi liniji, ki naseljujeta jadranski in savski rečni sistem. Jadranski lipan (j. lipan) živi v porečju Pada in Adiže v Italiji in v porečju Soče v Sloveniji. Čeprav danes j. lipana večinoma uvrščajo v vrsto T. thymallus, je bil na osnovi morfološkega opisa že l. 1848 poimenovan kot samostojna vrsta T. aeliani. Različnost j. lipana so potrdile tudi sodobne genetske raziskave.

J. lipan je v Sloveniji zelo ogrožen zaradi intenzivnega podpornega vlaganja z umetno vzrejenim savskim lipanom, ki je trajalo do l. 2006, kar je povzročilo nastanek hibridne populacije in izginotje čistih primerkov j. lipana v soškem porečju.

Ker j. lipan in ribogojniška savska populacija izhajata iz zelo različnega okolja, med njima zelo verjetno poleg evolucijske obstaja tudi adaptivna divergenca. Križanje adaptivno divergentnih linij lahko privede do zamenjave alelov, ki vzdržujejo prilagojenost na lokalno okolje, z alohtonimi, ki te lastnosti nimajo (depresija zaradi »out-breedinga«), in do znižanja »fitnessa« lokalne populacije.

Poskus repopulacije j. lipana v Sloveniji temelji na vzreji genetsko najprimernejših osebkov iz narave, ki pa ne presegajo 40% genetske čistosti. Njihova identifikacija poteka z nevtralnimi mikrosatelitnimi markerji, ki pa ne dajejo informacije o selekcijskem pritisku okolja, zato obstaja vprašanje, ali je pri j. lipanu prišlo do depresije zaradi »out-breedinga«, in tudi, ali plemenski lipani, odbrani z nevtralnimi markerji, ohranijo adaptivnost na naravno okolje in le-to v zadostni meri prenesejo na svoje potomce, ki so namenjeni repopulacijskemu vlaganju. V porečju Adiže so nedavno odkrili populacije j. lipana z več kot 90% avtohtonim genetskim deležem. Translokacija le-teh v soško porečje bi lahko pripomogla k dvigu jadranskega genetskega deleža slovenske populacije, vendar obstaja vprašanje, ali sta populaciji adaptivno kompatibilni. Vzreja mladic lipana je težavna a precej olajšana, če temelji na plemenski jati, ki se jo vzdržuje v kontroliranih ribogojniških razmerah, vendar pri tem obstaja nevarnost njene domestikacije in posledično slabe prilagojenosti njenega potomstva na naravne razmere. Zastavlja se vprašanje, kako obsežna je v resnici adaptivna divergenca med ribogojniško in divjo lipansko populacijo.

Da bi odgovorili na ta vprašanja, bomo uporabili molekularno orodje za odkrivanje markerjev, na katerih se odraža vpliv selekcije zaradi različnega okolja (adaptivni markerji), kar bomo izvajali preko identifikacije SNP-lokusov na kodirajočih regijah genoma. Zadosten kvantitativni obseg SNP-lokusov bomo zagotovili z RAD sekvenciranjem. Kvantifikacijo adaptivne diferenciacije med primerjanimi skupinami bomo ugotavljali preko identifikacije odstopajočih SNP lokusov glede na njihovo visoko Fst vrednost (t.i. »outlier lokusi«).

Adaptivno diferenciacijo bomo na osnovi kandidatnih genov ugotavljali tudi preko različne stopnje metilacije DNA primerjanih skupin in preko tega signala sklepali na njihove razlike v stopnji genske ekspresije in posredno na epigenetsko pogojeno prilagajanje na specifično okolje.

Rezultati projekta bodo bistveno pripomogli pri odločitvah genetskega upravljanja z jadranskim lipanom in na ta način pomembno doprinesli k učinkovitejši repopulaciji te ogrožene vrste v Sloveniji.

Po našem védenju bo v Sloveniji to prva raziskava, ki bo temeljila na varstveni genomiki prostoživečih organizmov, in bo poleg raziskovalne novosti predstavljala tudi izhodišče za nadaljnje podobne študije na drugih ogroženih vrstah.

FAZE PROJEKTA IN NJIHOVA REALIZACIJA

WP 1: Izbira populacij in zbiranje vzorcev

WP2: Priprava RAD knjižnic in sekvenciranje

WP3: Bioinformatska analiza in identifikacija SNP-jev, pridobljenih z RAD sekvenciranjem

WP4: Individualne in populacijske analize RAD sekveniranja

WP5: Seznam identificiranih nevtralnih in SNP-jev pod selekcijskim pritiskom pri lipanu

WP6: Metilacija DNK

WP7: Bioinformatska analiza metilacijskega testa

WP8: Presoja statusa jadranskega lipana na podlagi SNP rezultatov

Časovna razporeditev dela na projektu:

Prvo leto:

• Zbiranje vzorcev: organizirali bomo zbiranje vzorcev v Sloveniji in v tujini. Pri zbiranju vzorcev bodo sodelovali sodelavci RD Tolmin, RD Bled, ZZRS v Sloveniji in A. Gandolfi v Italiji,
• Izolacija visokokvalitetne DNA,
• Pričetek genotipizacije z RAD sekvenciranjem (izdelava knjižnic),
• Izbor kandidatnih genov za analizo metilacije,
• Bisulfitna konverzija izolirane DNA,
• Priprava testa za bisulfitno sekvenčno PCR,
• Priprava znanstvene objave;

Drugo leto:

• Nadaljevanje genotipizacije z RAD sekvenciranjem
• Bioinformatska analiza podatkov RAD sekvenciranja (detekcija t.i. outlier in nevtralnih SNP markerjev, anotacija, Blast iskanje, določanje GO ontologije,…)
• Sekvenciranje bisulfitno konvertirane DNA
• Identifikacija metiliranih in nemetiliranih mest v kandidatnih genih,
• Priprava znanstvene objave;

Tretje leto:

• Identifikacija markerjev, ki so pod vplivom selekcije (outlier SNP),
• Selekcija SNP markerjev, karakterističnih za jadranskega lipana, potencialno uporabnih v nadaljnjih korakih varstvene genetike lipana v soškem porečju,
• Populacijsko genetska analiza na osnovi velikega števila SNP markerjev iz RAD sekvenciranja,
• Predstavitev vseh na novo odkritih SNP markerjev, uporabnih za populacijsko genetske analize pri drugih populacijah lipana,
• Analiza diferenciacije med skupinami/populacijami lipana glede na stopnjo metiliranih mest v kandidatnih genih,
• Primerjava diferenciacije med skupinami/populacijami lipana glede na outlier SNP markerje in glede na stopnjo metiliranih mest,
• Ovrednotenje statusa jadranskega lipana v soškem porečju in v Italiji glede na informacije pridobljene tekom projekta; ovrednotenje možnosti prenosa lipana iz Italije v Slovenijo; primerjava z objavljenimi rezultati klasičnih populacijsko genetskih analiz,
• Priprava znanstvene objave;

Zunanja povezava na SICRIS povezava Odpira se v novem oknu