Raziskovalni projekti

VSEBINSKI OPIS PROJEKTA

Znanstvena izhodišča: Nedavno smo objavili raziskavo, v kateri smo odkrili sposobnost sorodstvenega prepoznavanja bakterije Bacillus subtlis med rojenjem, kjer smo med naravnimi izolati prvič pokazali obstoj sorodstvenih (kin) skupin. Roji visokosorodnih sevov (kin sevov) se med rojenjem združijo, medtem ko se med roji manj sorodnih (non-kin) sevov na stični točki pojavi vidna mejna linija. Združitev rojev smo opazili samo med najbolj sorodnimi sevi. Podobno so kin sevi na površini korenin tvorili mešane biofilme, medtem ko je ob inokulaciji korenine z mešanico non-kin sevov v biofilmu prevladal samo en sev, kar kaže na antagonistično razmerje med non-kin sevi. Opis problema: Predlagani projekt se osredotoča na proučevanje ekološke in evolucijske vloge sorodstvene diskriminacije talne bakterije B. subtilis. Ta mikroorganizem je industrijsko in kmetijsko zelo pomemben, saj je v uporabi kot biognojilo za spodbujanje donosa pridelkov in bio zaščito kmetijskih rastlin pred patogeni. Nove smernice za razvoj biognojil vodijo v razvoj mešanic različnih bakterijskih sevov. Ni znano, ali bo antagonistično obnašanje med non-kin sevi B. subtilis na koreninah vplivalo na zdravje rastlin, ali bo to vedenje zaščitilo rastlino pred patogeni? Cilji raziskave: Namen projekta je ugotoviti odnos med sorodstveno diskriminacijo in teritorialnostjo, horizontalnim genskim prenosom in funkcijami ekosistema – to je bio kontrolno aktivnostjo B. subtilis. Določili bomo vzpodbujevalne lastnosti sevov B. subtilis na rast rastlin in njihovo bio kontrolno aktivnost. Sestavili bomo mešanice kin in non-kin sevov, ki jih bomo testirali na rastlinah za njihov biokontrolni potencial. Izvedli bomo primerjalno genomiko sevov B. subtilis s poudarkom na tem, kako porazdelitev antagonističnih lokusov sovpada s filogenetsko razdaljo, sorodstvenimi skupinami in ferotipi. Izvirnost rezultatov: Glede na to, da antagonistične interakcije med non-kin sevi B. subtilis vključujejo izločanje protimikrobnih spojin, pričakujemo, da ta interakcija ščiti rastlino pred vdorom patogenov zaradi prisotnosti protimikrobnih snovi. Mehanizem zaščitniškega delovanja bakterije B. subtilis je lahko tudi tekmovanje z ostalimi bakterijami za kolonizacijo površine korenin. Ta vprašanja še niso bila raziskovana v povezavi s sorodstveno diskriminacijo in so zato nova. Rezultati dajejo poleg boljšega razumevanja temeljnih zakonitosti sorodstvene diskriminacije tudi biotehnološki potencial za razvoj bakterijskih pripravkov za pospeševanje rasti in zaščito rastlin. Metode: Projektni skupini so na razpolago sevi dveh okoljskih zbirk B.subtilis, in sicer talni in rizosferni izolati. Pripravili bomo številne fluorescentno označene seve, s pomočjo katerih bomo opazovali nastanek biofilma, rojenje in kolonizacijo korenin s fluorescenčno mikroskopijo. Izvedli bomo bioinformacijsko analizo genomov in ovrednotili metodo MLST. Analizirali bomo izražanje ključnih genov, ki sodelujejo v rastlinski obrambi, ki izhajajo iz interakcije z različnimi kombinacijami sevov Bacillus. Potencial in relevantnost rezultatov: Le nekaj mikrobnih vrst je sposobnih sorodstvene diskriminacije in naša skupina je bila prva na svetu, ki je omenjen fenomen odkrila pri bakteriji B. subtilis. Predlagani projekt predstavlja izviren pristop, znanje, ki ga bomo pridobili, bo omogočalo 1) razvoj novih metod za spremljanje sorodstvene diskriminacije s fluorescenčnim mikročitalcem, fluorescenčnim stereomikroskopom in uporabo fluorescenčno označenih sevov; 2) globlje razumevanje mehanizmov, ki so odgovorni za kin in non-kin izmenjavo DNK in vpliv tega pojava na ekologijo, socialnost in evolucijo te vrste; 3) izboljšanje razumevanja medvrstnih interakcij v kontekstu spodbujanja rasti rastlin in/ali biokontrolne aktivnosti. Ker bodo rezultati izvirni in zanimivi za širšo znanstveno skupnost, bomo objavili svoje raziskave v najuglednejših znanstvenih revijah.

FAZE PROJEKTA IN NJIHOVA REALIZACIJA

DS1: Sorodstveno prepoznavanje sevov B. subtilis izoliranih iz korenin paradižnika
Trajanje: 12 mesecev
Cilji: v sklopu tega DS želimo 1) proučiti dinamiko sorodstvenega prepoznavanja sevov B. subtilis, ki so bili izolirani iz površine korenin dveh rastlin paradižnika ter 2) proučiti kolonizacijo korenine mešanih (kin in non-kin) kultur B. subtilis. V okviru tega DS bomo pripravili tudi dodatne fluorescenčne poročevalce, s katerimi bomo lahko vizualizirali bakterijske seve in sestavo biofilma na površini korenine s konfokalnim fluorescentnim mikroskopom. Seve iz rizosfere paradižnika smo uvrstili v sorodnostne skupine in ugotovili, da so se ob stiku rojev različnih sevov iz paradižnika vedno pojavile mejne linije, zlitje smo opazili le pri eni kombinaciji sevov B. subtilis, od katerih je bil eden izoliran iz peščenih tal in drugi iz rizosfere paradižnika. Pri kolonizaciji korenine smo v primeru inokulacije bolj sorodnih ('kin') izolatov opazili prisotnost obeh sevov na korenini, medtem ko je pri inokulaciji manj sorodnih ('non-kin') izolatov na korenini prevladal le en sev. Sklepamo, da so prevladujoče interakcije med roječimi sevi večinoma ‘non-kin’, kar se odraža v nastanku mejne linije in kolonizacije korenine in da izvor sevov (rizosfera paradižnika 1 ali 2) ni vplival na kin prepoznavanje med sevi, ki so bili izoirani iz rizosfere iste korenine. Pri tem smo tudi uspešno vpeljali in optimizirali metodo gojenja A. thaliana in testiranja kolonizacije korenine s sevi B. subtilis.

DS2: Povezava med sorodstvenim prepoznavanjem in teritorialnostjo bakterij
Trajanje: 12-30. mesec
Cilji: v sklopu tega DS želimo ugotoviti, ali je sorodstveno prepoznavanje povezano s teritorialnostjo bakterij. Preverili bomo, ali pride pri razširjanju genetsko heterogenega roja po poltrdnem gojišču do ločevanja kin in non-kin sevov v posamezne pasove ter vpliv genetsko heterogene mešanice sevov na lokalizacijo celic v biofilmu. Metodologijo, ki temelji na fluorimetričnem spremljanju razširjanja roja po površini agarja v času in vizualizaciji pod fluorescentno lupo, bomo v tem DS optimizirali. Do sedaj smo pripravili več različnih talnih izolatov B. subtilis, ki smo jih označili s fluorescentnimi proteini (YFP oz. mKate) pod konstitutivnimi promotorji (ki se stalno izražajo tekom rasti seva). Optimizirali smo fluorimetrično spremljanje rojenja po površini in naredili že tudi nekaj poskusov s fluorescentnim čitalcem za mikrotitrske plošče ter delno optimizirali obdelavo podatkov. Začeli smo s preverjanjem vpliva sorodstvene diskriminacije na zasedanje površin pri rojenju, kolonizaciji korenin in tudi pri tvorbi biofilmov. Prvi rezultati nakazujejo, da mešanice ‘kin’ sevov rojijo skupaj po plošči in da si tudi lahko medsebojno pomagajo, saj si lahko izmenjajo javne dobrine (npr. surfaktin). Nasprotno se ‘non-kin’ sevi izključujejo, ponavadi ploščo preraste en sam sev oz. občasno pride do t.i. segregacije, to je vidno kot prostorsko ločeno rojenje obeh sevov, vendar ne po isti površini.  

DS3 Vpliv sorodstvene diskriminacije na horizontalni prenos genov
Trajanje: 12-30. Mesec
Cilji: v sklopu DS3 želimo raziskati vpliv sorodstvene diskriminacije na stopnjo transformacije (prenos DNK). Uporabili bomo test prepoznavanja med roji B. subtilis na poltrdnem gojišču, v stičnih točkah rojev bomo določili stopnjo transformacije med bodisi kin ali non-kin sevi. Ker pride med non-kin sevi do mejne linije, v kateri so prisotne večinoma mrtve celice, predvidevamo, da bo v liniji tudi prisotna DNK in bo prenos proste DNK iz okolice v bakterijske celice omogočen. Prav tako bomo določili, ali sevi preferenčno privzamejo manj sorodno DNK ali raje privzamejo lastno DNK z dodajanjem eksogene DNK v poltrdno gojišče B, po katerem bodo bakterije rojile. V sklopu prve naloge smo pripravili 14 konstitutivno označenih sevov B. subtilis (od tega 7 v genu sacA in 7 v genu amyE pod istim promotorjem p43 in dvema različnima florescenčnima oznakama: YFP in CFP). Vsak sev vsebuje tudi gen za odpornost proti antibiotiku (SpR ali CmR). Z uporabo pripravljenih sevov smo določali stopnjo izmenjave DNK na stičišču dveh rojev. Različni oznaki sevov z genom za antibiotično odpornost sta omogočili, da smo lahko eksperimentalno sledili horizontalnemu prenosu DNK med sevi s selekcijo transformant odpornih proti obema antibiotikoma. Predpostavili smo, da bo zaradi interakcij med sevi pogostost izmenjave DNA pogostejša na območju stičišča rojev non-kin sevov, kot med roji kin sevov. S poskusi smo določili pogostost transformacije na območju srečanja rojev 4 parov kin sevov in 3 parov non-kin sevov ter tudi pogostost transformacije na stiku rojev izogenih sevov z različnimi konstitutivnimi označbami. Pri tem so naši rezultati pokazali, da je delež transformant višji na območju srečanja rojev non-kin sevov.

DS4 Genomika
Trajanje: 12-34. mesec
Cilji: v sodelovanju z prof. S. Sǿrenson-om smo pridobili zaporedja genomov 21. izolatov B. subtilis iz mikrookolja tal. Po potrebi bomo sekvencirali še izbrane seve iz rizosfere. V sklopu DS4 bodo ti genomi osnova za primerjalno genomiko. Glavna cilja tega projekta sta 1) določiti genetske sorodstvene skupine izolatov na osnovi večjega števila »core« genov; 2) na podlagi pridobljenih anotacij genov in odsekov kromosoma ugotoviti prisotnost/odsotnost genov v posameznih genomih ter te genomske podatke povezali s fiziološkimi podatki, ki jih že imamo na voljo o sevih iz mikrookolja tal (ferotipi, kin skupine, ekotipi, vpliv na rastlino, genetska kompetenca, itd.) 3) določiti zaporedja profagov, toksin/antitoksin parov in potencialnih antibiotičnih lokusov. V okviru DS4: vsi mejniki v tem sklopu segajo v drugo leto projekta, kljub temu smo genome izolatov B. subtilis iz nabrežja reke Save že sestavili in anotirali. Trenutno smo v fazi pridobivanja znanja in uporabe orodij, ki nam bodo omogočili podrobnejšo analizo genomov.

DS5 Pospeševanje rasti rastlin in biozaščita
Trajanje: 16-36. mesec
Cilji: v DS5 želimo določiti kombinacije sevov B. subtilis, ki bi jih lahko nadalje uporabili kot biopospeševalce rasti rastlin in zaščitnike pred rastlinskimi škodljivci. V sklopu eksperimentov DS5 bomo izolatom B. subtilis, izoliranim iz peščenih tal in korenin paradižnika, ki so na voljo raziskovalni skupini, določili sposobnost pospeševanja rasti dveh izbranih rastlin npr. tobak (Nicotiana tabacum), paradižnik (Solanum lycopersicum) ali krompir (Solanum tuberosum). Prav tako bomo preverili biozaščitno fukcijo sevov B. subtilis iz naših zbirk proti rastlinskemu patogenu Ralstonia solanacearum.

V okviru DS5 je v delu izolacija in karakterizacija sevov iz rizosfere paprike z namenom najti PGPR seve (plant growth promoting rhizobacteria), ki spodbujajo rast rastlin in/ali jim nudijo biozaščito pred različnimi bakterijskimi rastlinskimi patogeni, npr. Ralstonia solanacearum. Iz rizosfernih tal feferona smo izolirali 253 izolatov, ki jim bomo določili vrstno pripadnost s pomočjo sekvenciranja gospodinjskega gena gyrA, prav tako bomo preverili PGP lastnosti: produkcija indol ocetne kisline (IAA), ACC deaminaze, raztapljanje fosfatov in tvorbo sideroforjev.

SICRIS povezava