Raziskovalni projekti

Vsebinski opis projekta

Kot pritrjeni organizmi, se morajo rastline nenehno prilagajati okoljskim spremembam. V ta namen akumulirajo ione različnih elementov (ionom) in sintetizirajo obilico biokemičnih spojin (metabolom). Ionom in metabolom predstavljajo dinamične in prostorsko porazdeljene komponente in za boljše razumevanje njihovih odnosov z anatomskimi, fiziološkimi in genetskimi lastnostmi rastlin, je potreben razvoj analiznih tehnik z možnostjo vpogleda v prostorsko razporeditev elementov in biomolekul na različnih organizacijskih ravneh organizmov (organ, tkivo, celica). Ker s posamezno instrumentalno tehniko ne moremo zagotoviti celostne informacije o elementni in biomolekularni prostorski zgradbi rastlinskih tkiv, nameravamo v okviru projekta SLOEMP vzpostaviti multi-modalno instrumentalno platformo in razviti protokole za celostno slikanje elementne in biokemijske sestave tkiv na enem vzorcu. Instrumentalna platforma bo vključevala tehnike kot so u-PIXE, MeV-SIMS in u-FTIR. Projekt SLOEMP bo z razvojem novih orodij za celostno slikanje porazdelitve elementov in biomolekul v rastlinskih tkivih odprl nov vpogled v razumevanje biomolekularnih procesov pri rastlinah, ki bodo na dolgi rok vodile v izboljšanje rastlinske produkcije, kakovosti in varnosti hrane

Sestava projektne skupine

• povezava 

Faze projekta in njihova realizacija

SLOEMP je komplementaren ERC CoG projekt (MIBPLANT), katerega namen je vzpostaviti multimodalno instrumentalno platformo  (MIP) za korelativno zajemanje informacij o morfologiji bioloških vzorcev in porazdelitvi elementov in biomolekul na tkivni ravni. MIP z možnostjo korelativne analize na enem vzorcu (»single sample«), bi omogočila poglobljene študije tako rastlinskih kot živalskih vzorcev in bi predstavljala napredno orodje za proučevanje različnih problematik od vpliva onesnažil (kovine, mikroplastika) na organizme, do študij različnih kroničnih bolezni in rakavih obolenj pri človeku.

Glavni cilji:

- Vzpostavitev multimodalne instrumentalne platforme za celovito prostorsko biokemično analizo rastlin na tkivni ravni s kombiniranjem komplementarnih spektrometričnih tehnik s fokusiranim žarkom (u-PIXE, u-FTIR in MeV-SIMS).

- določiti nove delovne tokove za pripravo vzorcev za multimodalno slikanje na "enem vzorcu", namenjeno neposredni korelaciji anatomskih in biokemičnih značilnosti na tkivni ravni;

- Analiza in kvantifikacija spektroskopskih podatkov za zmanjšanje spektralnih informacij 3D podatkovnih kock na ustrezne informacije; osnovna kemometrična analiza slike z obstoječo programsko opremo.

Prilagojeni projekt SLOEMP je razdeljen v 4 sklope.

DS1: Multimodalna instrumentalna platforma (MIP).

V MIP smo povezali naslednje instrumente: svetlobni mikroskop (BF), u-PIXE (IJS), MeV-SIMS (IJS), u-FTIR (Elettra, KI) in SEM (IJS).

Kot predvideno v ciljih projekta, smo določili delovni tok meritev za zajemanje informacij o zgradbi in porazdelitvi elementov in biomolekul na tkivni ravni. Delovni tok je preizkušen na primeru tkivne rezine zrna ajde (3). Pregled tehnik je objavljen v poglavju monografske publikacije (4).

Naloga 1.1. Slikanje anatomskih struktur vzorca

Za slikanje histoloških struktur vzorca smo uporabili svetlobni mikroskop (Carl Zeiss, Axioskop 2 MOT). Na osnovi histoloških struktur je možno jasno določili regije, ki služijo kot referenčne točke za meritve z drugimi tehnikami. Kot podlago za analizo slik, ki jih pridobimo s tehnikami za slikanje porazdelitve elementov in biomolekul, smo vključili tudi SEM (2,3).

Naloga 1.2. Slikanje porazdelitve biomolekul

Slikanje porazdelitve metabolitov z MeV SIMS je bilo izvedeno na zrnu ajde (1,2). Ocenili smo tveganja, ki vključujejo predvsem dostopnost instrumenta. Zaradi pandemije COVID-19 v letih 2020/21 nismo imeli dostopa do u-FTIR preko sinhrotronskih institucij, zato smo se povezali z raziskovalci na KI. Dogovori o sodelovanju so v teku.

Naloga 1.3. Mapiranje porazdelitve elementov

V okviru te naloge smo utrdili povezave s številnimi tujimi partnerji na področju mapiranja porazdelitve elementov v rastlinskih tkivih z u-PIXE in sinhrotronsko u-XRF in skupaj objavili 5 publikacijah (5-9).

DS2: priprava vzorca

Definirali smo glavne izzive pri pripravi vzorcev za MIP in poskušali najti ustrezne rešitve. Glavni izziv pri pripravi rastlinskih vzorcev je ohraniti histološko strukturo vzorca in hkrati intaktno porazdelitev biomolekul in elementov. Za ohranitev anatomske in morfološke strukture se lahko uporablja sveže rastlinsko tkivo, vendar to ni kompatibilno z vakuumskimi tehnikami (MeV SIMS in u-PIXE) in u-FTIR zaradi interferenc z molekulami vode. Poleg tega bi se med posameznim sklopom meritev tkivo razkrojilo, kar bi neugodno vplivalo na biomolekularno sestavo (aktivacija litičnih encimov) in porazdelitev elementov (plazmoliza). Drug način je kemijska fiksacija, ki je neustrezna, ker ostanki fiksativa motijo določanje biomolekularnih profilov s FTIR in SIMS, hkrati pa prihaja do izpiranja mobilnih elementov. Edini ustrezen način priprave je torej nativna kriofiksacija in priprava tkivnih rezin debeline 20-30 um na kriotomu, ki smo jo predhodno razvili za mapiranje porazdelitve elementov in jo že rutinsko uporabljamo (5-9). Take razine so kompatibilne z ATR-u-FTIR, ne pa z u-FTIR v transmisijskem načinu. Za slednji način morajo biti rezine debeline 10-15 um (2,3,4), kar še vedno predstavlja izziv. V letu 2021 smo na BF kupili vibratom (Precisionary), ki omogoča pripravo tankih rezin svežega tkiva in naknadno zamrzovanje in liofilizacijo. Testiranje tega načina priprave je v teku.

DS3 analiza spektrov

Pripravili smo delovni tok obdelave PIXE spektrov s programom GEOPIXE (10,11)

DS4 »Proof of concept«

V okviru projekta testiramo različne biološke objekte, kot je razvidno iz publikacij (5-9)

Dosežki

1)    VOGEL-MIKUŠ K. et . Key contributions of ion beam imaging techniques to plant ionomics. V: PONGRAC, Paula (ur.). ICNMTA2020 : 17th International Conference on Nuclear Microprobe Technology and Applications, 14-15 September 2020, on-line : book of abstracts, 17th International Conference on Nuclear Microprobe Technology and Applications, 14-15 September 2020, on-line. Electronic ed. Ljubljana: Jožef Stefan Institute. 2020, str. 21. https://www.icnmta2020.org/en/. [COBISS.SI-ID 35044099]

2)    VOGEL-MIKUŠ K. et al. Challenges in the multimodal imaging of metal-stressed plants : lecture at IAEA Technical Meeting on Imaging Using Ionizing Radiation to Address Biological Challenges, 30 November - 3 December 2020, (Virtual Event). [COBISS.SI-ID 62491395]

3)    PONGRAC P. et al. Challenges in the Imaging cell-types in plants using correlative ion beam techniques MeV-SIMS and micro-PIXE at the Jožef Stefan Institute, Slovenia : lecture at IAEA Technical Meeting on Imaging Using Ionizing Radiation to Address Biological Challenges, 30 November - 3 December 2020, (Virtual Event). [COBISS.SI-ID 62489347]

4)    VOGEL-MIKUŠ K. et al. Distribution of nutritional and mineral components in important crop plants. V: UPADHYAY, Santosh Kumar (ur.). Genome engineering for crop improvement. Hoboken (NJ): Wiley. 2021, str. 22-42, doi: 10.1002/9781119672425.ch2. [COBISS.SI-ID 62668035]

5)    ALCOCK T. et al. Magnesium and calcium over-accumulate in the leaves of a schengen3 mutant of Brassica rapa. Plant physiology. IF= 6.9 [in press] 2021, 41 str. [COBISS.SI-ID 59167235]

6)    COMINELLI E. et al. Calcium redistribution contributes to the hard-to-cook phenotype and increases PHA-L lectin thermal stability in common bean low phytic acid 1 mutant seeds. Food chemistry. IF= 6.3. 15 Aug. 2020, vol. 321, 126680, str. 1-10 [COBISS.SI-ID 33286183]

7)    DETTERBECK A. et al. Temporal and spatial patterns of zinc and iron accumulation during barley (Hordeum vulgare L.) grain development. Journal of agricultural and food chemistry. IF=4.2 [in press] 2020, 12 str [COBISS.SI-ID 33245443],

8)    HÖRETH S.et al. Arabidopsis halleri shows hyperbioindicator behaviour for Pb and leaf Pb accumulation spatially separated from Zn. The new phytologist. IF=8.5 2020, vol. 226, iss. 2, str. 492-506. [COBISS.SI-ID 33005607]

9)    PONGRAC P. et al. Mineral element composition in grain of awned and awnletted wheat (Triticum aestivum L.) cultivars : tissue-specific iron speciation and phytate and non-phytate ligand ratio. Plants. . IF=2.8 2020, vol. 9, no. 1, str. 79-1-97-14. [COBISS.SI-ID 33018919]

10) PONGRAC, Paula. Image analysis of element distribution maps…. 2021. 1 spletni vir. https://repozitorij.uni-lj.si/IzpisGradiva.php?id=126923&lang=slv. [COBISS.SI-ID 62029059]

11) PONGRAC P. et al. OM DAQ - GeoPIXE for beginners. [COBISS.SI-ID 15626755]