Raziskovalni projekti

VSEBINSKI OPIS PROJEKTA

V cilju zadovoljitve vse večjega povpraševanja po hrani in v skladu z vse strožjimi okoljskimi zahtevami, kmetijstvo mora z ene strani poskrbeti za povečanje proizvodnje in kakovosti hrane, z druge strani pa za zmanjševanje škodljivih ekoloških posledic. S tem povezane strategije vključujejo tudi učinkovit nadzor nad škodljivci, oz. nadomestitev kemičnih pesticidov prve generacije z novejšimi, varnejšimi in okolju prijaznejšimi biopesticidi.

Ostreolizin A6 (OlyA6), pleurotolizin A2 (PlyA2) i erilizin A (EryA) so proteini iz glivnega rodu Pleurotus. Nedavno so odkrili da se omenjeni proteini, ki sodijo v proteinsko družino egerolizinov, specifično vežejo na ceramid fosfoetanolamin (CPE); membranski sfingolipid specifičen za nevretenčarje (še posebej za žuželke). Glive rodu Pleurotus proizvajajo tudi protein pleurotolizin B (PlyB) z domeno kompleksa, ki napade membrano/perforin (ang. membrane attack complex/perforin; MACPF). Protein PlyB lahko v kombinaciji z egerolizini OlyA6, PlyA2 ali EryA tvori bikomponentne multimerne transmembranske pore v umetnih in bioloških membranah, ki vsebujejo fiziološko pomembne koncentracije CPE. Ta lastnost kompleksov egerolizin/PlyB bi se lahko uporabila za selektivno zatiranje organizmov, katerih celične membrane vsebujejo molekularno tarčo za egerolizine, CPE.

Predlagani projekt temelji na spodbudnih rezultatih, ki smo jih dobili v okviru nacionalnega raziskovalnega projekta J4‐7162. V okviru tega projekta smo z uporabo prehranjevalnih testov pokazali potencial kompleksov OlyA6/PlyB, PlyA2/PlyB in EryA/PlyB za selektivno zatiranje ličink in odraslih osebkov dveh ekonomsko najbolj pomembnih škodljivcev iz reda Coleoptera (hrošči): koruznega hrošča (Diabrotica v. virgifera) in koloradskega hrošča (Leptinotarsa decemlineata). Toksičnost omenjenih proteinskih kompleksov je bila primerljiva s toksičnostjo proteinskih toksinov Cry, v primeru koloradskega hrošča celo višja. Toksini Cry so proteini bakterije Bacillus thuringiensis, ki se že več desetletij uporabljajo za razvoj genetsko modificiranih poljščin v cilju zatiranja rastlinskih škodljivcev. Toksini Cry delujejo insekticidno preko vezave za (gliko)proteinske receptorje v membranah črevesnih celic žuželk, zato žuželke zelo hitro razvijajo rezistenco proti tem toksinom. Glede na to, da kompleksi OlyA6/PlyB, PlyA2/PlyB in EryA/PlyB delujejo na specifični membranski lipidni receptor, in ne na proteinske receptorje podvržene mutacijam, je verjetnost za razvoj rezistence proti omenjenim egerolizinskim insekticidnim kompleksom zelo majhna.

V okviru predlaganega projekta želimo podrobneje osvetliti potencial kompleksov OlyA6/PlyB, PlyA2/PlyB in EryA/PlyB za zatiranje koloradskega hrošča. V ta namen nameravamo razviti genetsko spremenjene rastline krompirja, ki bodo izražale omenjene insekticidne komplekse. Podrobneje bomo raziskali tudi molekularne mehanizme delovanja kompleksov OlyA6/PlyB, PlyA2/PlyB in EryA/PlyB tako, da bomo (1) proučili mehanizem tvorbe pore na membranah, ki vsebujejo CPE in (2) poiskali morebitne dodatne proteinske in lipidne receptorje v črevesu občutljivih žuželk.

Testirali bomo tudi toksičnost kompleksov egerolizin/PlyB na ostale ekonomsko pomembne škodljive žuželke, kakor tudi na ne‐tarčne žuželke (npr. čebele) in na glodalce.

Predlagana raziskava bo zapolnila manjkajoče vrzeli na področju molekularnih mehanizmov delovanja insekticidnih egerolizinskih kompleksov, in odprla vrata za nadaljnji razvoj novih okolju prijaznih bioinsekticidov s podaljšanim delovanjem.

FAZE PROJEKTA IN NJIHOVA REALIZACIJA

Trenutno smo v fazi optimizacije sekvenc OlyA, PlyA2, EryA in PlyB za transfekcijo v rastlinah. Izvedli smo preliminarne poskuse s krioelektronsko mikroskopijo v cilju določanja tvorbe OlyA/PlyB por na umetnih membranskih veziklih, ki vsebujejo CPE. Ravno tako smo izvedli preliminarne lipidomske študije koloradskega hrošča. Testiranje toksičnosti na netarčnih organizmih je planirano za pomlad 2020.

Povezava na Sicris