Številka pogodbe:

J4-9307

Oddelek:

Oddelek za agronomijo

Tip projekta:

ARRS

Vrsta projekta:

Temeljni

Vloga na projektu:

Vodilni

Financiranje:

Trajanje:

01.07.2018 - 30.06.2021

Vrednost projekta skupaj:

1.34 FTE

Vodja projekta na BF:

Murovec Jana

VSEBINSKI OPIS PROJEKTA

Rod Brassica je sestavljen iz številnih vrst in podvrst, od katerih se za prehrano ljudi in živali uporabljajo poganjki, listi, korenine, koreni ali semena. Vegetativni deli rastlin se uporabljajo predvsem sveži, medtem ko se semena predelajo v olja, pogače, moko, beljakovine ali začimbe. V procesu udomačitve in žlahtnjenja vrst so nastali številni agronomsko pomembni morfotipi, tako vrsta B. oleracea danes obsega sorte zelja, ohrovta, kodrolistnega ohrovta, brstičnega ohrovta, kolerabe, brokolija, cvetače; vrsta B. rapa obsega sorte pak choi, kitajskega zelja, strniščne repe in oljnih sort. Vrsta B. napus je alopoliploid, ki je nastal s križanjem vrst B. oleracea in B. rapa in kasnejšo podvojitvijo genoma. Tudi pri vrsti B. napus poznamo številne morfotipe, od katerih je najpomembnejša oljna ogrščica, saj po pridelani količini predstavlja kar tretjo najpomembnejšo oljnico na svetu.

Kljub temu, da so vrste rodu Brassica zelo pomembne tako ekonomsko kakor v prehrani ljudi in živali, najnovejši biotehnološki pristopi namenjeni njihovemu žlahtnjenju še niso bili razviti. V zadnjih letih je sicer bilo objavljenih nekaj člankov o preurejanju genomov, vendar so vse raziskave temeljile na vnosu DNA ekspresijskih vektorjev s pomočjo stabilne transformacije z bakterijo A. tumefaciens. Uporaba transgeneze v procesu žlahtnjenja rastlin lahko predstavlja precejšnjo oviro pri kasnejšem sproščanju novo nastalih sort, še posebej v državah, kjer imajo regulacijo GSO vezano na postopek.

Zato menimo, da je potrebno razviti nove metode za preurejanje genomov vrst rodu Brassica, ki ne bodo temeljile na vgradnji heterologne DNA v rastlinski genom. V tem oziru se nam zdijo ribonukleoproteinski kompleksi Cas9 in sgRNA (RNPji) sistema CRISPR/Cas9 optimalna rešitev.

RNPji imajo v primerjavi z ostalimi ekspresijskimi metodami to prednost, da omogočajo tarčno mutagenezo brez uporabe DNA, kar je uporabno predvsem za aplikativne namene v kmetijstvu. Poleg tega uporaba Cas9 encima skupaj z ustrezno sgRNA zmanjša pojavnost ne-tarčnih razrezov DNA (in z njimi povezanih ne-tarčnih mutacij), kar je še vedno glavna pomanjkljivost metode CRISPR/Cas9 v primerjavi s starejšimi metodami (meganukleaze, TALEN in ZFN).

Glavni cilj projekta je razviti metode preurejanja genomov vrst rodu Brassica, ki bodo temeljile na vnosu RNPjev v protoplaste in mikrospore ter regeneraciji rastlin iz teh celic.

Projekt bo združeval temeljne znanstvene raziskave in aplikacijo pridobljenih rezultatov v kmetijstvu. Pričakovani rezultati bodo vplivali na implementacijo najsodobnejših tehnologij v področji žlahtnjenja rastlin in rastlinske biotehnologije in bodo pomembno prispevali k njunem nadaljnjem razvoju.

Projekt je zasnovan v sodelovanju priznanih znanstvenikov z dokazanimi izkušnjami (objavami) iz komplementarnih področij povezanih s temo projekta. Izmenjava znanj, metod in znanstvenih pristopov bo omogočila nove perspektive in rešitve ter tako razvoj vključenih znanstvenih področij. To sodelovanje obeta odlične znanstvene rezultate in tehnološke rešitve, ki lahko pripeljejo do patentne prijave.



FAZE PROJEKTA IN NJIHOVA REALIZACIJA

1 Priprava RNPjev

1.1 Bioinformacijska analiza (zaključena)

1.2 Sinteza sgRNA (zaključena)

1.3 Proizvodnja rekombinantnega Cas9 proteina (zaključena)

1.4 Testiranje in vitro aktivnosti RNPjev (zaključena)

2 Izolacjia, transformacija in regeneracija iz protoplastov in mikrospor vrst rodu Brassica

2.1 Optimizacija izolacije in regeneracije iz protoplastov (zaključena)

2.2 Izolacija in regeneracija mikrospor (zaključena)

2.3 Transformacija protoplastov in mikrospor (v teku)

2.4 Obogatitev suspenzij protoplastov in mikrospor (v teku)

2.5 Testiranje uspešnosti preurejanja genomov (v teku)

3 Preurejanje genov za agronomsko pomembne lastnosti

3.1 Razvoj zelja odpornega na Xcc (v teku)

3.2 Razvoj linij zelja s spremenjenim CENH3 genom (v teku)

 

SICRIS povezava