Slika1_Mešani glivno bakterijski biofilmi na EPDM gumijastih tesnilih v pomivalnih strojih
Slika1: Mešani glivno bakterijski biofilmi na EPDM gumijastih tesnilih v pomivalnih strojih

 

Exophiala dermatitidis je v naravi redka, prilagodila pa se je na človeška notranja okolje 

Prof. dr. Nina Gunde-Cimerman je pojasnila, da danes živimo v dobi antropocena, kar pomeni, da živimo v organiziranem svetu velikih mest, prometa, v okoljih kjer je tudi veliko onesnaženja. V razvitem svetu kar 90 % življenja preživimo v notranjih okoljih. Skupaj z mikroorganizmi, ki so se na te pogoje prilagodili. 

Med ekstremna notranja okolja, ki smo jih ustvarili ljudje, sodi tudi pomivalni stroj. Temperature v pomivalnem stroju so lahko zelo visoke, do 60° C.  pH zaradi detergentov lahko naraste vse do 12, detergenti povzročajo tudi oksidativni stres. Raziskovalci so dolgo mislili, da je notranjost pomivalnega stroja aseptična,  da v njem ni ničesar živega.

 

Slika3_Vzorčenje pomivalnih strojev po svetu
Slika2: Vzorčenje pomivalnih strojev po svetu

Raziskovalna skupina, ki jo vodi prof. dr. Nina Gunde-Cimerman, je  pokazala, da ni tako: »Če pogledamo tesnilo iz umetne gume na vratih pomivalnega stroja, vidimo, da ga naseljujejo mikro glive, med njimi so tudi črne kvasovke, ki skupaj z bakterijami gumo uspešno razgrajujejo in na njej oblikujejo biofilme. Vzorčenje  pomivalnih strojev smo začeli v Sloveniji in ga nadgradili v globalno študijo, ki je zajela vse celine, od Arktike pa do Avstralije. V celoti smo vzorčili preko 220 pomivalnih strojev.« Ugotovili so, da se v strojih obogatijo  določene oportuno patogene glive. Svoje ugotovitve so objavili v članku, ki je spodbudil veliko zanimanje ljudi po vsem svetu – članek si je ogledalo več kot 500 milijonov ljudi.

Globalna študija je pokazala, da je v pomivalnem stroju prisotnih pet vrst oportuno patogenih gliv, Exophiala dermatitidis, Exophiala phaeomuriformis, Candida parapsilosis, Magnusiomyces sp. in Rhodotorula mucilaginosa. Pomivalni stroj s svojimi ekstremnimi pogoji  - torej visoko temperaturo, vlago in visokimi pH vrednostmi - vrši selekcijski pritisk, ki skoraj vedno obogati prav teh omenjenih pet vrst gliv, uniči pa ostale. V vseh pomivalnih strojih, od Arktike do Avstralije, je največji delež med omenjenimi šestimi glivami, kar 30 %, zasedla Exophiala dermatitis, ki so jo v nadaljevanju tudi raziskovali.

 

Črna kvasovka Exophiala dermatitis

E. dermatitidis je poliekstremotolerantna gliva, saj lahko raste tako pri visokih kot nizkih temperaturah, pri širokem razponu pH, od 2 do 12, in tudi v okolju z minimalno hranil.

Ta črna kvasovka je prisotna v pitni vodi, ampak v zelo majhnih koncentracijah, morda ena celica na 10 l vode. Ko vstopi v pomivalni stroj, so tam pogoji, ki uničijo konkurenco, omogočajo pa njeno razmnoževanje in naseljevanje notranjosti stroja. V stroju tako ni prisotna samo na tesnilih, ampak  po celi površini stroja. Tudi na kovinskih in plastičnih delih, celice se izpirajo tudi v odpadno vodo, ki se nato izteka v kanalizacijo

Raziskava je pokazala, da 1 cm2 tesnila pomivalnega stroja naseljuje 1.4x10⁶ celic črne kvasovke Exophiala dermatitidis. To so izjemno velike količine, in to pri inkubaciji pri temperaturi 37° C, kar je telesna temperatura človeka. Zakaj je to pomembno? Ker je Exophiala dermatitidis skoraj neznana v naravnem okolju. V  naravi jo najdemo le redko, globalno obstaja le nekaj sevov. Dokler je nismo našli v pomivalnih strojih je bila poznana predvsem iz pacientov. Povzroča lahko namreč oportune sistemske okužbe, kolonizacijo črevesja, podkožne okužbe, naseljuje pljuča, pojavlja se pri pacientih s cistično fibrozo, in, najpomembneje, povzroča nevtropne okužbe možgan.

Slika4_Citotoksičnost metabolitov v ekstraktih E. dermatitidis na celice nevroblastov SH-SY5Y
Slika3: Citotoksičnost metabolitov v ekstraktih E. dermatitidis na celice nevroblastov SH-SY5Y
(a) Potek ekstrakcije biomase. (b) vodni  (c) DMSO-razredčeni etanolni ekstrakt. Po 48 h testirana viabilnost celic nevroblastov.

 

Nevrotropna črna kvasovka Exophiala dermatitidis deluje nevrotoksično na nevroblastomske celice in povzroči njihovo smrt 

Raziskovalna skupina je izvedla kronski poskus pri katerem so spremljali, kaj se dogaja z nevroblasti, ob neposrednem  stiku s črno kvasovko Exophiala dermatitidis. Hife črne kvasovke vstopijo v celice nevroblastov, jih preidejo in za seboj pustijo opustošenje. Rezultati poskusa prikazujejo nov, doslej še neopisan način vstopa nevrotropnih gliv v možgane,  preko perifernega živčevja in pokažejo, kako bi se lahko nevrotropne glive širile v možganih. Do obstoječe raziskave je veljalo, da nevrotropne glive vstopajo v možgane preko pljuč, aerosolno, ali direktno preko travmatske poškodbe. Nove ugotovitve pa postavljajo povsem nove temelje razumevanja prodora preko perifernega živčevja in izpostavljajo posredne in neposredne razloge za razvoj določenih nevrodegenerativnih bolezni, kot je npr. Alzheimerjeva bolezen. 

 

Kako glive pridejo v možgane?

C75T9423

Prof. dr. Nina Gunde-Cimerman je pojasnila: »Pred kronsko raziskavo smo vedeli, da pridejo glive v možgane tako, da vdihnemo sporo ali košček micelija, ki lahko preide v pljuča in paranazalne sinuse, nato pa preko možgansko krvne bariere v možgane, ali pa, da lahko pridejo direktno v glavo preko travmatskih poškodb

Raziskovalno skupino pa je zanimalo ali lahko glive vstopijo preko perifernega živčnega sistema in kako se širijo po možganih. Za raziskavo so se odločili zaradi novih spoznanj na področju Alzheimerjeve bolezni. Nedavno je bilo odkrito, da so sistemske mikoze (glivne okužbe) eden od vzrokov ali celo glavni dejavnik pri razvoju te bolezni. Pri teh bolnikih so našli tako kvasovke kot hife, tako v kot izven možganskih nevronov. 

V okviru raziskave so najprej pogledali ali gliva raste pri telesni temperaturi človeka, kar je predpogoj za patogenost. Potrdili so rast pri 37° C v obliki posameznih kvasnih celic, ki se združujejo v pseudo hife. Gliva je bila pri 37° C bistveno bolj črna, se pravi bolj melanizirana in zato  tudi bolj patogena. 

Nato je raziskovalce zanimalo ali črna kvasovka lahko asimilira aromatske ogljikovodike kot edini vir ogljika. Prof. dr. Nina Gunde-Cimerman je pojasnila: »To nas je zanimalo, ker črno kvasovko E. dermatitidis lahko do neke mere najdemo še v okoljih, kjer se mešata voda in različni ogljikovodiki, npr. v avtopralnicah, na železniški tramovih … Razgradni produkti določenih ogljikovodikov so  strukturno zelo podobni nevrotransmiterjem v perifernem in centralnem živčnem sistemu. Glivo smo zato gojili na mineralnem olju, toluenu in na fenolu, kot edinem viru ogljika, gliva je asimilirala vse troje. Potem smo jo gojili na različnih nevrotrasmiterjih, na acetilholinu, GABA, dopaminu, glicinu, glutamatu,  in dejansko je bila sposobna asimilirati kot edini vir ogljika vse naštete

Slika5_Melanizirani ekstracelularni vezikli (EV) imajo signifikantno večji citotoksični učinek kot nemelanizirani EV
Slika5: Melanizirani ekstracelularni vezikli (EV) imajo signifikantno večji citotoksični učinek kot nemelanizirani EV
a) Normalizirani fraktogram (črna črta) ne-melaniziranih Ev. (b) TEM ne-melaniziranih Ev. Merilo: 250 nm (c) Frakcije nemelaniziranih  EV E. dermatitidis so bile analizirane glede gostote, celokupnih proteinov (µg), in vsebnosti melanina (A400). (d) Citotoksični učinek ne-melaniziranih Ev dodanih SH-SY5Y celicam – meritve viabilnosti.

V nadaljevanju je raziskovalce zanimalo, ali črna kvasovka sintetizira toksične metabolite. V ta namen so izolirali metabolite vodnih in tudi organskih ekstraktov biomase črne kvasovke ter z njimi delovali na celično linijo nevroblastov SH-SY5Y. Ugotovili so, da oba tipa metabolitov znižujeta preživelost nevroblastov od 30 do 40%.  

Prof. dr. Nina Gunde-Cimerman je opisala nadaljevanje poizkusa: »Zanimalo nas je, če gliva izloča v okolje ekstracelularne vezikle - to se mikro vezikli, ki so bili doslej opisani le pri maloštevilnih glivah in imajo lahko pomembno vlogo pri patogenih procesih. « To je tehnično zahteven postopek, s  katerim so pridobili mešanico ekstracelularnih veziklov, različnih velikosti, ki so jih nato ločili in ovrednotili ter ugotovili, da so med njimi tako melanizirani kot tudi nemelanizirani. Ugotovili so, da predvsem melanizirani vezikli drastično znižujejo preživelost nevroblastov, vse tja do 70 %. S tem je bila dodatno potrjena vloga melanina kot pomembnega virulentnega faktorja.

 

Soočenje nevroblastov SH-SY5Y in črne kvasovke Exophiala dermatitidis v rastnem poskusu

Slika6_SOOČENJE E. dermatitidis IN NEUROBLASTOV (SEM)
Slika 6: SOOČENJE E. dermatitidis IN NEUROBLASTOV (SEM)
Scale bar: 10 μm (black), 1 μm (white).
Prvi stoplec prikazuje poskus po 24 urah, drugi po 48 urah in tretji po 72 urah.

Rastni poskus so spremljali s presevno elektronsko mikroskopijo. Dokazali so prodor hif črne kvasovke do celice nevroblastov v roku 12ih ur, v roku  24ih ur je črna kvasovka prodrla v nevroblast. Hifa, ki jo je po začetnem stiku začela oblivati citoplazma nevroblastov, se je širila po celici in prodrla skozi.  Po 48ih urah je bilo vidno, da je začel nevroblast propadati, kar je vodilo do apoptoze oziroma celične smrti nevroblastov. Po 72 urah je bil skupek nevroblastov popolnoma uničen. S pomočjo konfokalne flourescenčne mikroskopije smo časovno spremljali kako je črna kvasovka vstopila v celico, obšla jedro, izstopila iz celice  in za seboj pustila propadlo celico.  

Prof. dr. Nina Gunde-Cimerman je povzela zaključke raziskave: »Ugotovili smo, da se je gliva Exophiala dermatitidis, ki je v naravnem okolju skoraj ne najdemo, izjemno prilagodila na naša notranja okolja. Kot vir hrane lahko uporablja določene tipe plastike, razgrajuje aromatske ogljikovodike, prenaša visoke temperature gospodinjskih naprav in oksidativni stres detergentov, kadar pa ji uspe preiti v ekstremno okolje našega telesa pa lahko kot vir hrane uporablja nevrotransmiterje, kar ji omogoča širjenje po živčnem sistemu. Citotoksično delovanje črne kvasovke je kompleksno in se odraža  na mnogo nivojih, od tega, da izloča melanizirane mikro vezikle, do tega da sintetizira različne citotoksično metabolite. Oboje ji omogoča prodor v celice nevroblastov in njihovo uničenje. S tem smo dokazali nov, doslej še neopisan dostop nevrotropnih gliv preko perifernega živčevja v možgane

Rezultati raziskave predstavljajo posreden dokaz vloge ekstremnotolerantnih gliv  pri Alzheimerjevi bolezni in drugih nevrodegenerativnih obolenjih. 
Prof. dr. Nina Gunde-Cimerman je poudarila, da je bila opisana raziskava izjemno interdisciplinarna in se za sodelovanje zahvalila vsem sodelujočim raziskovalcem, ki delujejo na Medicinski fakulteti, Veterinarski fakulteti, Fakulteti za kemijo in kemijsko tehnologijo, Kemijskem inštitutu, Institutu Jožef Stefan in seveda Biotehniški fakulteti.