Metoda za enkapsulacijo DNA v bakteriji omogoča razvoj biotehnoloških procesov

02.09.2022

Metoda za enkapsulacijo DNA v bakteriji omogoča razvoj biotehnoloških procesov

Raziskovalke in raziskovalci Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani so skupaj z raziskovalci Inštituta Jožef Stefan ter raziskovalci Univerze v Birminghamu, Anglija razvili metodo enkapsulacije DNA v bakteriji, ki je bila prvič predstavljena v objavi avgusta 2022. V vrhunski znanstveni reviji Nucleic Acids Research (IF: 19,16) so jo predstavili v izvirnem znanstvenem članku z naslovom A method for targeting a specified segment of DNA to a bacterial microorganelle / Metoda za enkapsulacijo DNA v bakteriji. Ključne poskuse za razvoj in validacijo metode sta z Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani izvedla Jan Otoničar, ki je raziskavo opravil v okviru diplomske in magistrske naloge študijskega programa Biotehnologija in Maja Hostnik, doktorska študentka Bioznanosti. Poleg njiju sta s Katedre za biokemijo sodelovala še dr. Maja Grundner in izr. prof. dr. Matej Butala, ki je vodil raziskavo. Z Oddelka za biologijo so raziskavo izvedli še asist. Tajda Gredar, prof. dr. Rok Kostanjšek, oba s Katedre za zoologijo, izr. prof. dr. Cene Gostinčar ter dr. Zdravko Podlesek, oba s Katedre za molekularno genetiko in biologijo mikroorganizmov. Sekvenciranje DNA so izvedli v laboratoriju prof. dr. Jerneja Jakšeta, s Katedre za genetiko, biotehnologijo, statistiko in žlahtnjenje rastlin Oddelka za agronomijo.

Izr. prof. dr. Matej Butala je predstavil raziskavo: »Vklopite računalnik in zaženejo se vam programi za izvedbo različnih nalog. Podobno metoda, ki smo jo razvili omogoča, da ob dodatku arabinoze v gojišče sprožimo v bakterijah program z navodili za sintezo proteinov, orodij, ki omogočijo izrez in pakiranje specifične DNA v zaprto lupino grajeno iz proteinov – t. i. mikrorazdelek. Mikrorazdelke lahko nato afinitetno izoliramo iz celic. Dokazali smo, da je v izoliranih mikrorazdelkih obogaten izbrani odsek DNA s tarčnimi zaporedji za vezavo vsaj dveh različnih proteinov, ne pa tudi DNA, ki obdaja ta vezavna mesta. Študija nakazuje, da tekom samosestavljanja proteinske lupine mikrorazdelka, nukleaze odstranijo DNA, ki bi lahko sterično ovirala zaprtje lupine. Proteini lupine, ki smo jih uporabili v študiji so sicer strukturne komponente metabolosomov, primitivnih organelov bakterij, tako rezultati prispevajo tudi k razumevanju njihove izgradnje.«

Zmožnost enkapsulacije izbranega odseka DNA v živi celici, lahko omogoči razvoj ali izboljšanje biotehnoloških procesov. Na primer, encime sklopljene z DNA vezavnimi proteini bi lahko nanizali na DNA kot obeske po verižici. Encimi razporejeni v prostoru, en poleg drugega, zvečajo učinkovitost metabolnih reakcij, lupina, ki obdaja encime, pa bi preprečila, da bi morebitni toksični intermediati enkapsuliranih metabolnih poti prišli v stik z molekulami v citoplazmi celice. V takih umetnih organelih bi lahko torej vodili tudi za celico sicer toksične procese.

Slika: (A) Shematski prikaz plazmidov, ki omogočata enkapsulacijo izbranega odseka DNA z vezavnimi mesti za DNA vezavne protein v bakteriji E. coli. Ob dodatku arabinoze v gojišče bakterije sprožimo sintezo kvasne restriktaze (I-SceI), ki vodi izrez izbranega odseka DNA in proteina Gam, ki izrezano DNA stabilizira. Na izrezani fragment se veže fuzijski protein LacI, sklopljen z zelenim fluorescentnim proteinom in peptidno značko (PduD1-18). Slednja omogoči, da kompleks LacI-DNA obdajo proteini Pdu, ki se sestavijo v zaprto lupino – mikrorazdelek. Metoda omogoča, da mikrorazdelek z ujeto DNA afinitetno izoliramo iz bakterij. DNA, ki ni bila enkapsulirana, odstranimo z nukleazami. (B) Fluorescenčna mikroskopija bakterijskih celic v katerih smo sprožili sintezo mikrorazdelka Pdu v katere se je vključil protein PduD(1-18)-LacI-EGFP. (C) Transmisijska elektronska mikroskopija afinitetno izoliranih mikrorazdelkov. (D) Visokozmogljivo sekvenciranje DNA v mikrorazdelkih pokaže na enkapsulacijo fragmenta DNA z osmimi vezavnimi mesti za protein LacI. (E) Shematski prikaz predvidenega vpliva nukleaz tekom samosestavljanja mikrorazdelka.

Otoničar J, Hostnik M, Grundner M, Kostanjšek R, Gredar T, Garvas M, Arsov Z, Podlesek Z, Gostinčar C, Jakše J, Busby SJW, Butala M. A method for targeting a specified segment of DNA to a bacterial microorganelle. Nucleic Acids Res. 2022 Aug 27:gkac714. doi: 10.1093/nar/gkac714. PMID: 36029110.

Financiranje: ARRS [J1-8150, J4-1778, P1-0060, P1-0207, P4-0077, P1-0198 in mreža raziskovalnih infrastrukturnih centrov UL: IC za raziskave molekulskih interakcij ter IC Mikroskopija bioloških vzorcev].