Ikona iskalnik Ikona iskalnik
Gumb išči

Biologija

 

Delo raziskovalne skupine za biokemijo je usmerjeno v raziskave zgradbe in funkcije beljakovin ali drugih snovi, ki se vežejo z biološkimi ter umetnimi lipidnimi membranami oz. nekaterimi receptorji v membranah, jih preoblikujejo in v njih tvorijo transmembranske pore. V zvezi s temi procesi preučujemo potencialno uporabo teh beljakovin (ali drugih snovi) v biomedicini, farmaciji in drugje. Tehnike, ki jih uporabljamo, spadajo v niz biokemijskih preparativnih in analitskih metod in molekularno-bioloških metod. Pripravljamo in preučujemo lastnosti modelnih lipidnih sistemov kot so umetni lipidni vezikli različnih velikosti (SUV, LUV, GUV), lipidne kapljice in Langmuirovi lipidni monosloji. S pomočjo površinske plazmonske resonance in Langmuirjeve tehtnice preučujemo kinetiko in interakcije proteinov z lipidnimi membranami in drugimi ligandi (proteini, nukleinskimi kislinami, manjšimi ligandi). Rutinsko merimo aktivnost različnih encimov (predvsem holinesteraz in encimov oksidativnega stresa) v bioloških vzorcih ter izvajamo analize kinetike encimske aktivnosti. V okviru katedre deluje Infrastrukturni center za raziskave molekulskih interakcij.

 

BI-katedre_Biokemija_1.jpg

Zaposleni

 

PEDAGOŠKA DEJAVNOST

Študijski programi 1. in 2. stopnje:

  • Biologija: Biokemija, Toksinologija, Bioinformatika, Genomika in proteomika, Molekulska biologija membran, Molekulska biologija genov, Molekulski mehanizmi toksičnosti
  • Mikrobiologija: Biokemija, Mikrobna biokemija, Mikrob in patogeneza (toksikoze)
  • Biotehnologija: Biokemija, Osnove bioinformatike
  • Biologija-kemija in Biologija-gospodinjstvo (Pedagoška fakulteta): Biokemija

Podiplomski študijski program

  • Bioznanosti: Molekulska in sistemska biologija, Biološke teme za nebiologe, Toksini in biomembrane, Interakcije nukleinskih kislin in proteinov, Naravna zdravila iz gliv, rastlin in živali 
  • Interdisciplinarni doktorski študijski program Biomedicina: Izbrana poglavja iz biokemije in molekularne biologije

 

OPREMA

Laboratorij ima opremo za raziskovanje na področjih biokemije, molekularne biologije in mikrobiologije. Oprema vključuje HPLC, nizkotlačno tekočinsko kromatografijo, FPLC, enote za elektroforezo in izoelektrično fokusiranje, napravo za PCR, UV-VIS spektrofotometra, spektrofluorimeter, dva VIS in fluorescenčna čitalca za mikrotitrske mikroplošče, Langmuirjevo tehtnico, sonikator, rotavapor, vakuumski koncentrator, dva stresalnika, centrifuge ter hladno komoro. V okviru katedre deluje Infrastrukturni center za raziskave molekulskih interakcij, ki premore dva refraktometra za merjenje površinske plazmonske resonance (Biacore X in Biacore T100 nadgrajen na nivo aparata T200) ter spektrometer s hitrim mešanjem raztopin (Stopped Flow SX-20). 

 

RAZISKOVALNO DELO

 

Pogodbeni raziskovalni projekti:

  • J4-1772 Proteinski kompleksi iz glivnega rodu Pleurotus kot novi biopesticidi za zatiranje koloradskega in koruznega hrošča 1.7.2019―30.6.2022 Sepčić Kristina
  • J4-1778 Uporaba malega proteina bakteriofaga v boju proti razvoju odpornosti proti antibiotikom pri bakteriji Staphylococcus aureus 1.7.2019―30.6.2022 Butala Matej
  • J1-9174 Mehanizem delovanja in sodelovanja treh ključnih listerijskih virulentnih faktorjev 1.7.2018―30.6.2021 Podobnik Marjetka
  • J7-1819 Mehanizem poškodb lipidnih membran povzročenih z Nep1-podobnimi proteini 1.7.2019―30.6.2022 Anderluh Gregor
  • J4-8225 Nove nanopore za aplikacije senzorike 1.5.2017―30.4.2020 Anderluh Gregor

 

Pogodbeni raziskovalni program:

  • P1-0207 Toksini in biomembrane (vodja: prof. dr. Igor Križaj, financira ARRS)

 

Aktinoporini in α-porotvorni toksini

Aktinoporini (Pfam 06369) so bazični, ~20 kDa α-porotvorni letalni toksini, prvotno izolirani iz morskih vetrnic. Izločajo se v monomerni obliki in se vežejo na umetne in biološke membrane, ki vsebujejo sfingomielin. V teh membranah oligomerizirajo, čemur sledi prehod  N-terminalnih α-vijačnic skozi membrano in tvorba transmembranske hidrofilne pore polmera ~2 nm. Ekvinatoksini iz morske vetrnice Actinia equina so močno citolitični, citotoksični in kardiotoksični predstavniki aktinoporinov, ki jih v našem laboratoriju proučujemo že več kot dve desetletji. 

BI-katedre_Biokemija_2.jpg

A) 3D struktura ekvinatoksina II (EqtII; PDB 1IAZ) z označenimi funkcionalnimi aminokislinskimi ostanki B) Superpozicija 3D struktur EqtII (PDB 1IAZ; rdeče), stiholizina III (StnIII; PDB 1O72; modro) in fragaceatoksina C (FraC; PDB 3LIM; zeleno). C) Razporeditev nabojev na primeru treh aktinoporinov.

Več na povezavi

 

Biološka vloga in aplikacije proteinov iz družine egerolizinov

Leta 2002 je naša skupina iz užitnih gob bukovega ostrigarja (Pleurotus ostreatus) in topolovke (Agrocybe aegerita) prvič izolirala in opisala 15 kDa velika proteina in ju poimenovala ostreolizin in egerolizin. Po slednjem je celotna družina dobila ime egerolizini. Trenutno šteje egerolizinska družina (Pfam06355, egerolizinska naddružina cl05705) čez 400 predstavnikov. Do sedaj so jih odkrili pri glivah, rastlinah in nekaterih patogenih bakterijah kot sta Pseudomonas aeruginosa in Vibrio cholerae. Skupna lastnost egerolizinov je njihova interakcija z lipidi, ki so sestavni deli bioloških membran. Nekateri se specifično povezujejo s sfingomielinom, glavnim sfingolipidom v membranah vretenčarjev, visokoafiniteni receptor vseh do sedaj testiranih egerolizinov pa je ceramid fosfoetanolamin, najbolj zastopan sfingolipid v membranah nevretenčarjev. Egerolizini lahko v kombinaciji s proteini z domeno MACPF tvorijo binarne citolitične komplekse ter tvorijo transmembranske pore v umetnih in bioloških membranah, ki vsebujejo za egerolizin specifični lipidni receptor. 

Lastnost egerolizinov, da specifično prepoznavajo in se vežejo na nevretenčarske membranske sfingolipide, kakor tudi prisotnost proteinov z domeno MACPF v istih organizmih, daje omenjenim proteinom potencial za razvoj sredstev za zatiranje različnih škodljivcev. V sodelovanju s kolegi iz Kmetijskega Inštituta Slovenije smo ugotovili, da so proteinski kompleksi na osnovi egerolizinov iz ostrigarjev so selektivno toksični proti dvema glavnima rastlinskima škodljivcema iz reda hroščev: proti koloradskemu in proti koruznemu hrošču, kar je posledica njihove stabilne interakcije z membranskimi lipidi, specifičnimi za žuželke. Toksičnost teh kompleksov proti koruznemu hrošču je primerljiva s toksičnostjo komercialno uporabnih proteinskih kompleksov iz bakterije Bacillus thuringiensis; v primeru koloradskega hrošča je toksičnost celo večja.

Zaradi sposobnosti specifičnega prepoznavanje membranskih lipidov so egerolizini zanimivi tudi kot označevalci. V našem laboratoriju smo pripravili in izolirali rekombinantni, fluorescenčno označeni egerolizin, ostreolizin A (OlyA-mCherry), za katerega smo pokazali, da se veže na s holesterolom in sfingomielinom bogata področja v membranah celic sesalcev. Z omenjenim označevalcem smo tudi dokazali obstoj teh domen v živih celicah in spremljali njihovo dinamiko potovanja po celici. Razvita molekula bi lahko v prihodnosti služila kot ključno orodje v bazičnih in aplikativnih biomedicinskih raziskavah biologije membranskih raftov in z njimi povezanih patoloških stanj. Možnost uporabe egerolizinov kot označevalcev membran celic skušamo sedaj pokazati še za nekatere druge egerolizine.   

BI-katedre_Biokemija_3.jpg

Mehanizem insekticidnega delovanja proteinskih kompleksov iz gliv ostrigarjev (rod Pleurotus). Glive iz rodu Pleurotus proizvajajo egerolizinske proteine in proteine z domeno MACPF. Egerolizini prepoznavajo za žuželke specifični membranski receptor ter se na njega vežejo, tej vezavi pa sledi še vezava partnerskega MACPF proteina in obsežna konformacijska sprememba le-tega. Proces se zaključi s tvorbo multimernih bikomponentnih transmembranskih por, ki permeabilizirajo membrane črevesnih celic koloradskega ali koruznega hrošča ter povzročijo smrt žuželk. Prikazane so polovične letalne doze (LD50) po 4-dnevni izpostavitvi ličink koloradskega hrošča (desno zgoraj) in po 7-dnevni izpostavitvi ličink koruznega hrošča kompleksom OlyA6/PlyB (desno spodaj). Povzeto po Panevska in sod., 2019, Scientific Reports, 9, 1: 5073.

Več na povezavi.

 

Izdelava metode za prepoznavo na DNA neposredno ali posredno vezanih proteinov v bakteriji

Za patogenost bakterij je ključna njihova zmožnost, da prilagodijo prepis svojih genov (npr. genov za dejavnike virulence, odpornost proti antibiotikom) razmeram v okolju. Potrebujemo metodo, da bi v določenih pogojih okolja prepoznali regulatorje gena izbranega virulenčnega dejavnika. Tako bi prepoznali nove protimikrobne tarče ter z učinkovinami proti njim prekinili ključne mehanizme v patogenih. Pred leti smo razvili protokol »DNA sampling«, ki omogoča hitro izolacijo specifičnega odseka DNA skupaj s proteini direktno iz bakterije Escherichia coli (slika spodaj). Metoda je omogočila identifikacijo le tistih proteinov, ki z visoko afiniteto interagirajo s tarčno DNA. Cilj projekta je izdelati učinkovito metodo za identifikacijo vseh regulatornih proteinov, vezanih na izbrane regije genomske DNA direktno v komenzalih in patogenih bakterijah. Izboljšali bomo protokol DNA sampling in ga povezali s statističnimi metodami in metodami strojnega učenja. Metoda nam bo omogočila prepoznati tudi metilacijski profil tarčne DNA ter analizirati aktivnost promotorja na odseku DNA, ki ga bomo analizirali.

BI-katedre_Biokemija_4.jpg

Shematski prikaz metode »DNA sampling«, povzeto po Grainger DC et al., Curr Opin Microbiol 2009. Obarvani krogi (rdeče zeleno) prikazujejo vezane proteine po genomu bakterije. Plazmid pASCBR-DL1 ni prikazan. Hkratna sprožitev sinteze I-SceI in proteina Gam bakteriofaga lambda omogočita sprostitev in stabilnost nukleoproteinskega kompleksa. Po lizi bakterije epitopsko označen (FLAG) LacI represor (rumeno), omogoči izolacijo in čiščenje fragmenta DNA skupaj s proteini (zeleno, modro), ki jih identificiramo po ločbi z NaDS-PAGE elektroforezo spojeno z masno spektrometrijo.

Več na povezavi.

 

Polimerne alkilpiridinijeve soli iz morske spužve kot nova protitumorska sredstva

Iz vodnega ekstrakta kruhaste spužve (Reniera sarai) smo izolirali polimerne 3-alkilpiridinijeve soli (poli-APS, tudi APS), ki kažejo zelo širok spekter zanimivih in potencialno uporabnih bioloških učinkov.

BI-katedre_Biokemija_5.gif

APS8, sintetični alkilpiridinijev polimer.

 

Med drugim delujejo kot antagonisti nekaterih nikotinskih podtipov acetilholinskih receptorjev (nAChR), kar je verjetno vzrok za selektivno citotoksičnost proti celicam ne-drobnoceličnega pljučnega raka (NSCLC), ki na svoji površini, v nasprotju z normalnimi pljučnimi celicami, izražajo tovrstne receptorje. Sodelavci iz Italije in Škotske so na temelju omenjenih rezultatov sinetizirali serijo polimernih 3-alkilpiridinijevih soli (APS). Trenutno potekajo obsežne raziskave njihovih bioloških učinkov, s katerimi skušamo predvsem ovrednotiti, ali bi bil lahko APS komercialno uporabni v medicini kot sredstvo za zdravljenje pljučnega raka.

BI-katedre_Biokemija_6.gif

APS8 povzroča apoptozo v celicah NSCLC, ne pa v normalnih fibroblastih. Apoptozo smo merili s pomočjo pretočnega citometra na celicah človeškega pljučnega adenokarcinoma (A549), skvamoznega karcinoma (SKMES-1) in na kontrolnih pljučnih fibroblastih (MRC-5). Celice smo 48 ur pred meritvami tretirali z APS8 (500 nM) ter jh pobarvali z aneksinom V in propidijevim jodidom. 

 

BI-katedre_Biokemija_7.jpeg

Protokol intratumorske aplikacije APS8 v tumorje humanega pljučnega karcinoma (A549) in humanega karcinoma debelega črevesja (HT29) (A). Prikaz rastnih krivulj po vnosu APS8 (4mg/kg) v tumorje pljučnega karcinoma (B-D) in v tumorje karcinoma debelega črevesja (E,F) za vsak individualni tumor.

Druga uporaba APS za biomedicinske namene

Poli-APS ustvarja v membranah prehodne pore, ki jih lahko izkoristimo za transfekcijo molekul DNA v celice. Druga možnost je transport proteinov tau v nevrone. Proteini tau so vpleteni v nekatere bolezni centralnega živčevja kot sta npr. temporalna demenca in Alzheimerjeva bolezen. Te raziskave opravljamo s kolegi na Univerzi v Aberdeenu na Škotskem.

APS kot protivegetativno sredstvo

V sodelovanju s skupino iz Genove smo opravili kar nekaj raziskav, v katerih smo preisušali APS kot potencialno aktivno učinkovino v protivegetativnih premazih za zaščito podvodnih površin- APS preprečujejo pritrjevanje organizmov kot so npr. ličinke rakov vitičnjakov vrste Balanus amphitrite, prav tako pa preprečujejo nastanek mikrobnih biofilmov.

Naravni produkti iz morskih organizmov kot inhibitorji encimov holinesteraz

Rezultati kliničnih raziskav kažejo, da je uporaba holinesteraznih inhibitorjev, ki upočasnijo hitrost razgradnje nevrotransmiterja acetilholina, ugodna strategija za blaženje simptomov Alzheimerjeve bolezni. V sodelovanju s kolegi iz Italije in Norveške vrednotimo sposobnost različnih morskih naravnih produktov in njihovih sintetičnhih analogov na sposobnost inhibicije encimov iz skupine holinesteraz (acetil- in butirilholinesteraze).

Več na povezavi.

 

Biologija bakteriofaga GIL01 

Virusi bakterij (bakteriofagi) pomembno vplivajo na ekologijo in evolucijo bakterij. Bakteriofagi so razvili raznolike in prefinjene molekularne mehanizme s katerimi si prilagodijo procese v bakteriji, da te sintetizirajo nove viruse, ki se sprostijo ob lizi gostiteljske bakterije. Pojasnili smo dosedaj še neopisano genetsko stikalo, s katerim baktriofag GIL01 bakterije Bacillus thuringiensis preklopi iz spečega, dormantnega cikla v sprožitev sinteze novih virusov. Dokazali smo, da proces uravnavata dva majhna proteina bakteriofaga. Prvi, gp7, uravnava delovanje transkripcijskega represorja LexA bakterije da vzpostavi dormantni cikel. Drugi, gp6, pa deluje kot genetsko stikalo, ki omogoči bakteriofagu, da spremeni svoj življenski slog in sproži nastanek novih virusov, ki zapustijo gostitelja. Pridobili smo kristalno strukturo proteina gp7 in na podlagi podatkov analize SAXS izdelali strukturni model proteina gp7 v kompleksu s proteinom LexA. Na podlagi struktur razvijamo učinkovine, ki bi z visoko afiniteto vezale tarčni protein bakterije LexA, ki bodo osnova za razvoj varnih “proti-evolucijskih” terapevtikov, ki bodo uporabljeni v kombinaciji z antibiotiki v boju proti infekcijam povzročenih s sevi Bacillus sp. in Staphlococcus aureus. Poleg naštetega nadalje preučujemo lastnosti bakteriofaga GIL01, poskušamo prepoznati molekularni mehanizem, ki omogoča GIL01 nadzor nad litičnim ciklom drugega bakteriofaga v bakteriji B. thuringiensis.

 

Nanoemulzije in umetne lipidne kapljice

Za proteine, ki se vežejo z membranami (npr. egerolizini) in toksine, ki tvorijo pore v lipidnih membranah (npr. aktinoporini, binarni pleurotolizini, bakterijski od holesterola odvisni citolizini), je značilno, da se vežejo z lipidnimi mono- in dvosloji z določeno lipidno sestavo in z značilnimi biofizikalnimi lastnostmi. Vezavo proteinov z lipidnimi monosloji preučujemo z uporabo Langmuirjevih monoslojev in dodatno s pomočjo umetnih lipidnih nano-kapljic premera 100 – 200 nm. Razvijamo metodo za pripravo nanoemulzij, to je nano-kapljic iz triacilglicerolov, ki so obdane z monoslojem iz amfifilnih membranskih lipidov (predvsem sfingomielina in holesterola), ki so obstojne v vodni fazi.

BI-katedre_Biokemija_8.jpg

TEM posnetek lipidnih kapljic sestave trioleoil/sfingomielin/holesterol.

Več na povezavi.

 

Ostale objave članov katedre si lahko ogledate na povezavi.

 

Zaposleni