Andraž Dolar v laboratoriju (Osebni arhiv).
V okviru magistrske naloge je Andraž Dolar optimiziral metode za spremljanje procesov povezanih z imunostjo v hemolimfi kopenskih rakov enakonožcev P. scaber. Meril je celične in humoralne parametre, ki so posredno ali pa neposredno vpleteni v delovanje prirojenega imunskega sistema rakov. Slednji parametri so namreč vse pogosteje uporabljeni indikatorji (tj. biomarkerji) v okoljskih raziskavah, v katerih se spremlja odziv poskusnega organizma po in vivo izpostavitvi najrazličnejšim onesnažilom. Dobro poznavanje zgradbe in delovanja imunskega sistema je namreč ključnega pomena za razumevanje in interpretacijo rezultatov, pridobljenih v okoljskih raziskavah.
Pomemben mejnik v raziskavah predstavlja podroben opis treh glavnih tipov hemocitov v hemolimfi asimptomatskih kopenskih rakov enakonožcev P. scaber. Opis temelji na uporabi različnih tehnik svetlobne in elektronske mikroskopije, s katerimi je pridobil podrobne morfološke opise celic hemolimfe pri raku enakonožcu P. scaber. Hkrati pa je uporabljeno diferencialno interferenčno mikroskopsko tehniko prepoznal kot hiter in zanesljiv pristop za spremljanje (analizo deleža) različnih tipov celic v svežih vzorcih hemolimfe.
Rak enakonožec P. scaber (Foto: Teo Delić).
Uspešnost optimizacije metod za merjenje celičnih in humoralnih parametrov v hemolimfi P. scaber je Andraž Dolar še dodatno preverili z ovrednotenjem vrednosti parametrov v hemolimfi živali z izraženimi simptomi bakterijske (Rhabdochlamydia porcellionis) in virusne okužbe (Iridovirus IIV-31). Pri tem delu raziskave je predpostavil, da lahko obstoječe biokemijske metode določanja humoralnih parametrov, ki so bile prvotno uporabljene pri drugih nevretenčarjih, omogočajo merjenje parametrov v hemolimfi iz posameznih osebkov P. scaber. Z optimizacijo protokolov, pogojev merjenja in primerjalno analizo vrednosti merjenih parametrov v hemolimfi asimptomatskih živali in živali s simptomi okužbe, je potrdil uporabnost in občutljivost optimiziranih metod. S primerjalno analizo izmerjenih parametrov v hemolimfi živali s simptomatsko bakterijsko in virusno okužbo ter kontrolnimi živalmi, je odgovoril na zadnjo hipotezo, v kateri je predpostavljal, da se odziv P. scaber s simptomatsko bakterijsko oziroma virusno okužbo razlikuje na nivoju merjenih parametrov, ki so posredno oziroma neposredno povezani z imunskim sistemom.
V raziskavi je tako potrdil, da so vrednosti merjenih parametrov v hemolimfi simptomatskih živali značilno spremenjene v primerjavi s kontrolnimi oziroma asimptomatskimi P. scaber. Enakonožec P. scaber se na simptomatsko bakterijsko oziroma virusno okužbo odzove različno, tj. aktivirajo se različni procesi prirojene imunosti. Na podlagi rezultatov je zaključil, da so merjeni parametri v hemolimfi P. scaber zanesljivi in občutljivi biološki markerji za spremljanje procesov, povezanih z imunostjo
Andraž Dolar je pojasnil: »Izsledki raziskave predstavljajo osnovo za napovedovanje in razumevanje odziva organizma v primeru poskusov z različnimi kemikalijami in materiali (npr. pesticidi, nano/mikro-plastika), ki jih izvajamo v okviru raziskovalnega dela Skupine za nanobiologijo in nanotoksikologijo ter v sklopu nacionalnih kot tudi mednarodnih raziskovalnih projektov.«
Simptomatska bakterijska in virusna okužba enakonožca P. scaber.
Rezultati raziskave so bili objavljeni v znanstvenem prispevku z naslovom »Modulations of immune parameters caused by bacterial and viral infections in the terrestrial crustacean Porcellio scaber: Implications for potential markers in environmental research«, ki je bil objavljen v mednarodno priznani reviji s področja imunologije (Developmental & Comparative Immunology) ter predstavljeni na znanstveni konferenci ISTIB 2021 (International Symposium on Terrestrial Isopod Biology). Andraž Dolar je še povedal: »Dodatno pa smo trenutno vedenje o zgradbi in delovanju imunskega sistema pri rakih ter ugotovitve dosedanjih raziskav s kopenskimi raki P. scaber predstavili tudi v preglednem prispevku v slovenskem jeziku z naslovom »Imunski sistem pri rakih: predstavitev raziskav s kopenskim rakom Porcellio scaber«, objavljenem v reviji Acta Biologica Slovenica.«
Raziskava, ki je bila opravljena v okviru magistrske naloge, je pomembna z vidika poglobljenega poznavanja zgradbe in delovanja imunskega sistema pri kopenskih rakih P. scaber. Pridobljeno znanje je še toliko bolj pomembno, saj je preučevan kopenski rak nepogrešljiv testni organizem v vedenjskih, fizioloških in ekotoksikoloških raziskavah tako v Sloveniji kot tudi v tujini. Hkrati pa optimizacija novih, občutljivih in zanesljivih bioloških markerjev promovira uporabnost v okoljskih raziskavah, na podlagi katerih se podajajo ocene tveganja različnih onesnažil za organizme v okolju in oblikujejo zakonodajne regulative.