Agronomija

Vsebinski opis projekta

Tehnologija podvojenih haploidov je najmočnejša metoda za pospeševanje žlahtnjenja novih hibridnih sort, kar je še posebej pomembno pri žlahtnjenju dvoletnic, kot je zelje (Brassica oleracea var. capitata L.). Številne tehnike indukcije haploidov so bile razvite, vendar so obsežne študije o indukciji haploidov v zadnjem desetletju pokazale, da so številne rastlinske vrste in določeni genotipi znotraj vrst še vedno neodzivni na standardne tehnike indukcije haploidov. Pri navadnem repnjakovcu so bile nedavno objavljene točkovne mutacije v ohranjenem delu centromernega proteina CENH3, ki so povzročile nastanek haploidnega potomstva, kar kaže na to, da bi lahko rastline, ki imajo te mutacije, uporabili kot opraševalske linije za indukcijo haploidov pri neodzivnih genotipih. Tehnike tarčnega preurejanja genoma, kot je CRISPR/Cas9, se pogosto uporabljajo za tarčne spremembe v genomu različnih rastlinskih vrst. Kljub temu učinkovit in natančen nastanek točkovnih mutacij ostaja izziv. Tarčno preurejanje nukleotidov je nedavno, iz tehnologije CRISPR/Cas9 razvito orodje, ki omogoča natančne substitucije nukleotidov. Da bi vzpostavili učinkovit protokol za CRISPR/Cas9 in povzročili točkovne mutacije v genu cenh3, ki bi lahko privedle do razvoja linije za indukcijo haploidov pri zelju, bomo najprej preučili vpliv različnih parametrov na učinkovitost mutageneze, kot je protokol transformacije in konstrukcija vektorjev. V ta namen bo uporabljen pristop prehodnega izražanja vektorjev pri protoplastih, ki omogoča hitro in učinkovito analizo različnih parametrov in ponuja možnost optimizacije protokolov za tarčno preurejanje genoma pred pridobivanjem stabilno transformiranih rastlin. Z uporabo visoko zmogljive strategije kloniranja Golden Gate bomo pripravili različne vektorje CRISPR/Cas9, ki jih bomo testirali s prehodnim izražanjem pri protoplastih. Tarčna mesta v genomu zelja bomo analizirali z uporabo sekvenciranja naslednje generacije in preverili nastanek tarčnih mutacij. Poleg tega bomo optimizirali protokole regeneracije transformiranih rastlin. Glavni cilj predlaganega raziskovalnega projekta je vzpostaviti učinkovit protokol za tarčno preurejanje genoma z uporabo tehnologije CRISPR/Cas9 pri zelju, ki bo v prihodnosti omogočal tako funkcionalno analizo genov kot tudi izboljšanje rastlin ne samo pri zelju, temveč tudi pri drugih vrstah rodu Brassica. Nadaljnji cilj projekta je manipulacija gena cenh3 za pridobitev potencialnih linij za indukcijo haploidov, ki bi jih lahko uporabili pri neodzivnih genotipih. V ta namen bo uporabljen nov pristop tarčnega preurejanja nukleotidov, ki za vrsto B. oleracea L. še ni bil objavljen.

Faze projekta in njihova realizacija

Projekt bo organiziran v štiri glavne delovne sklope, ki bodo obravnavali vpliv različnih dejavnikov transformacije na učinkovitost transformacije protoplastov zelja (DS1;  mesec 1 do 3), oceno vpliva konstrukcije vektorjev CRISPR/Cas9 na tarčno mutagenezo (DS2;  mesec 4 do 8), prehodno izražanje vektorjev za tarčno preurejanje nukleotidov v protoplastih zelja in karakterizacijo nastalih zamenjav (DS3;  mesec 9 do 13), ter optimizacijo regeneracije transformiranih protoplastov (DS4;  mesec 9 do 23). [ŠA1] Da bi zagotovili pravočasno izpolnitev predlaganih nalog, so med projektom predvideni 4 mejniki: določitev optimalnih parametrov transformacije (M1; mesec 3), določitev učinkovite arhitekture vektorjev CRISPR/Cas9 (M2; mesec 8), ocena različnih deaminaz (M3; mesec 13) in razvoj učinkovitega protokola za regeneracijo transformiranih protoplastov zelja (M4; mesec 23).
 

Realizacija projekta:

DS1: Vzpostavitev učinkovitega protokola transformacije protoplastov zelja

N1.1 Testiranje različnih parametrov transformacije (zaključeno)

N1.2 Ocena učinkovitosti transformacije (zaključeno)

DS2: Optimizacija uspešnosti induciranja CRISPR/Cas9 mutacij

N2.1 Priprava različnih CRISPR/Cas9 vektorjev in transformacija protoplastov zelja (zaključeno)

N2.2 Določanje uspešnosti tarčnega preurejanja (zaključeno)

DS3: Zamenjave posameznih nukleotidov

N3.1 Izbor sgRNA in priprava TPN vektorjev (zaključeno)

N3.2 Prehodno izražanje v protoplastih in karakterizacija tarčnih zamenjav (zaključeno)

DS4: Regeneracija transformiranih protoplastov

N4.1 Primerjava različnih protokolov za regeneracijo protoplastov (zaključeno)

N4.2 Vnos TPN vektorjev in analiza uspešnosti (zaključeno)

Povezava na sistem SICRIS

Reference:

[1]  STAJIČ, Ester, KUNEJ, Urban. Uporaba tehnik tarčnega preurejanja genomov v podporo žlahtnjenju. V: ČEH, Barbara (ur.), et al. Novi izzivi v agronomiji 2023 = New Challenges in Agronomy 2023 : zbornik simpozija = proceedings of symposium : [Laško, 26. in 27. januar 2023]. Laško: Slovensko agronomsko društvo: = Slovenian Society of Agronomy, 2023. Str. 185-190. ISBN 978-961-94613-3-4. [COBISS.SI-ID 141877251]

[2]  STAJIČ, Ester, KUNEJ, Urban. Optimization of cabbage (Brassica oleracea var. capitata L.) protoplast transformation for genome editing using CRISPR/Cas9. Frontiers in plant science. 2023, vol. 14, art. 1245433, 9 str., ilustr. ISSN 1664-462X.  https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2023.1245433, Repozitorij Univerze v Ljubljani – RUL, DOI: 10.3389/fpls.2023.1245433. [COBISS.SI-ID 168169731]

[3]  STAJIČ, Ester. Improvements in protoplast isolation protocol and regeneration of different cabbage (Brassica oleracea var. capitata L.) cultivars. Plants. 2023, vol. 12, iss. 17, art. 3074, 12 str., ilustr. ISSN 2223-7747. https://www.mdpi.com/2223-7747/12/17/3074, Repozitorij Univerze v Ljubljani – RUL, DOI: 10.3390/plants12173074. [COBISS.SI-ID 168164355]